發(fā)布時間：2020-11-14 12:41

　　 目的:初級纖毛是一種進化上高度保守,存在于哺乳動物大部分細胞表面的,呈毛發(fā)狀的細胞器。其作為細胞的物理化學感受器和信號轉(zhuǎn)導中心,調(diào)控著細胞的增殖、極性、遷移和侵潤等生理病理過程。完整的結(jié)構(gòu)及正常的裝配和解聚是初級纖毛行使其生物學功能的基礎(chǔ)。纖毛缺失、纖毛相關(guān)基因的突變等均會引起纖毛功能障礙,導致纖毛病的發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn),大量已知化合物對初級纖毛的組裝與解聚有潛在影響,并會進一步影響惡性腫瘤、多囊性腎病等纖毛相關(guān)疾病的進展。而目前國內(nèi)外的纖毛體外研究模型,在鑒定大量藥物對初級纖毛完整性影響方面,都存在一定局限性。因此,本課題通過構(gòu)建基于熒光顯微鏡及相關(guān)分析軟件的高通量篩選方法,來篩選和鑒定在活細胞中對于纖毛組裝和拆卸有影響的化合物,以期更經(jīng)濟高效地從現(xiàn)有藥物中篩選出能影響纖毛結(jié)構(gòu)和功能的藥物、發(fā)現(xiàn)可能對纖毛病有影響的化合物。方法:在調(diào)研文獻后選擇ARL13B、SMO及MCHR1作為標記初級纖毛的標簽蛋白,采用基因工程技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hTERT-RPE1-ARL13B-EGFP、hTERTRPE1-SMO-EGFP、hTERT-RPE1-MCHR1-TdTomato細胞株。通過檢測標簽蛋白與纖毛標志蛋白的共定位情況、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中纖毛對血清刺激響應(yīng)的靈敏度等方式驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株中初級纖毛的結(jié)構(gòu)與基本功能。經(jīng)過驗證后,再根據(jù)血清誘導不同密度細胞的纖毛的解聚,模擬藥物促進纖毛分解的效果,以初步構(gòu)建高通量篩選影響纖毛完整性的藥物的方法。最后通過測試幾種已報道的能顯著影響纖毛分解的藥物對該方法進行檢驗,進一步驗證并優(yōu)化了該篩選方法。結(jié)果:采用分子克隆方式構(gòu)建的三種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株中,帶熒光標簽的ARL13B、SMO及MCHR1蛋白均定位于hTERT-RPE1細胞的初級纖毛上,且基本不影響初級纖毛的正常組裝、解聚及對外界刺激的響應(yīng)。構(gòu)建的基于ImageXpress成像系統(tǒng)及相關(guān)軟件的,在活細胞中進行的自動化高通量篩選方法,在細胞密度合適時,能有效分析鑒定出對纖毛解聚有顯著促進或抑制作用的藥物。結(jié)論:本課題構(gòu)建了藥物對活細胞中初級纖毛完整性影響的高通量篩選細胞模型,及其自動化分析方法,經(jīng)驗證本方法基本能鑒別顯著影響纖毛拆卸的藥物。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R96
【部分圖文】：

2圖 1.1 纖毛的結(jié)構(gòu)示意圖。（a）纖毛是由纖毛膜、軸絲和基體組成的毛發(fā)狀細胞器。根據(jù)的結(jié)構(gòu)不同，纖毛可分為三類：（b）初級纖毛，軸絲為“9×2 + 0”結(jié)構(gòu)，由 9 對外周雙微管與連接絲組成。（c）運動纖毛，由 9 對雙聯(lián)體微管、內(nèi)/外動力蛋白臂、輻條及 1 對中管組成，為“9×2+2”結(jié)構(gòu)。（d）節(jié)點纖毛，軸絲為“9×2 + 0”結(jié)構(gòu)，由九對雙重微管接絲和內(nèi)/外動力蛋白臂組成。Fig 1.1 Schematic diagrams of cilium structure. (a) Cilia is a hair-like organelle composed ciliary membrane, axoneme, and basal body. (b) Primary cilia: the axoneme is "9x2+0" struconsisting of nine pairs of doublet microtubules and nexin. (c) Motile cilia consist of 9 pairs of dmicrotubules, inner/outer dynein arms, radial spoke and a pair of central singlet microtubules, wh"9x2+2" structure. (d) Node cilia: the axoneme is "9x2+0" structure, consisting of nine pairs of domicrotubules, nexin and inner/outer dynein arms.

江 蘇 大 學 碩 士纖毛軸絲的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是基體（或稱為母γ 微管蛋白）構(gòu)成，為軸絲 α、β 微管蛋白二軸絲外覆的纖毛膜是特化的細胞質(zhì)膜，完全相同[1, 14]。最近的一項蛋白質(zhì)組學研究表明，有六膜、纖毛基體及其相關(guān)附屬結(jié)構(gòu)上，這其中些受體蛋白，就像嵌在纖毛膜上的“探頭”物理、化學或生物信號分子刺激，然后將信子效應(yīng)器或 Hedgehog（Hh）[16-19]、Wnt[20-22等信號通路的相應(yīng)下游信號蛋白，從而調(diào)控細胞分化等生理病理過程，具體作用模式如

進纖毛分解；還可激活 INPP5E55 來抑制纖毛發(fā)生[37]。而在分子機制方面，目前纖毛在正�；虿±項l件下分解的具體機制相對而言研究較為清晰的是，在體外研究中，由血清引起的細胞纖毛分機制如下：在加入血清后，解聚驅(qū)動蛋白成員 Kif2a 和 Kif24 被HEF1-Aurora A 途徑迅速誘導纖毛軸質(zhì)微管去穩(wěn)定化和解聚合（圖 1.3）看，該過程首先是 G2 / M 期激酶 Plk1 磷酸化，激活解聚驅(qū)動蛋白 Kif2延伸[38]。隨后 Ndel1 穩(wěn)定基底體中的 Trichoplein，與 Pitchfork 一起激活HEF1，進而激活組蛋白去乙�；�酶 6（HDAC6）、促進微管蛋白去乙酰致纖毛解聚（圖 1.3）。最后，在 S 期和 G2 期表達的 Nek2 與定位于與的解聚驅(qū)動蛋白成員 Kif24 結(jié)合[39]，磷酸化并激活該第二解聚驅(qū)動蛋白期開始后拆解過程的不可逆性，保證了中心粒能夠在 S 期復制并在 M 期裂紡錘體[35]（圖 1.3）。
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本文編號：2883490