發(fā)布時間：2020-11-17 23:18

　　 研究背景與目的法米替尼是我國自主研發(fā)的1.1類新藥,也是一個多靶點的酪氨酸激酶抑制劑,對多種實體瘤均有較好的療效。然而,在其臨床應(yīng)用中仍存在著以下問題:(1)臨床前實驗表明法米替尼對中國非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者突變率較高的驅(qū)動基因表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)無抑制效果,而臨床試驗顯示其對EGFR野生型的患者有較好的療效,表明法米替尼的抗腫瘤機制尚不明確,仍需進一步驗證;(2)法米替尼對轉(zhuǎn)移性腎癌有較好的療效,但臨床上尚未找到與腎癌治療相關(guān)的特異性較強的生物標志物,仍需對法米替尼的臨床效應(yīng)相關(guān)因素進行探索。綜上,進一步探索法米替尼的作用靶點及作用機制,對推動法米替尼個體化用藥具有重要意義。本課題組前期基于激酶酶譜篩查平臺,檢測了法米替尼對275個蛋白激酶的抑制率,并結(jié)合各激酶在腫瘤中的意義,初步確定了棘皮動物微管結(jié)合樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(Echinoderm microtubule-associated protein-like4-Anaplastic Lymphoma kinase,EML4-ALK)融合基因的突變蛋白為其潛在靶點。因此,本課題將具有該遺傳背景的NSCLC細胞株NCI-H2228為主要研究對象,在細胞水平及動物水平對該靶點進行相關(guān)驗證,并初步闡明法米替尼作用機制。此外,本研究還將檢測臨床患者的血藥濃度,綜合臨床基本信息考察法米替尼療效及不良反應(yīng)的相關(guān)性因素,為法米替尼的個體化給藥提供科學依據(jù)。實驗方法與結(jié)果1.以克唑替尼為陽性對照藥,用CCK-8(Cell counting kit-8)法檢測法米替尼對NCI-H2228細胞的增殖抑制活性,同時考察法米替尼對該細胞凋亡、周期和遷移的影響。結(jié)果顯示,法米替尼對EML4-ALK融合基因突變的NSCLC細胞具有較好的活性抑制作用,且20nM法米替尼處理48 h后的NCI-H2228細胞與空白對照組相比,能使NCI-H2228細胞凋亡率顯著增加且周期阻滯在G0/G1期,同時法米替尼還能抑制其遷移,提示法米替尼具有抑制EML4-ALK突變的NSCLC增殖及促進凋亡的能力。2.分別用不同濃度法米替尼(5,10,20nM)處理NCI-H2228細胞48h后,采用免疫印跡法(Western blotting,WB)分析細胞中ALK及其下游蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示,法米替尼能夠顯著抑制ALK及其下游蛋白的磷酸化并促進凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)且呈劑量依賴性,提示法米替尼抑制NCI-H2228細胞活性可能與ALK/Akt/ERK/STAT3通路抑制有關(guān)。3.采用裸鼠皮下接種NCI-H2228細胞,建立體內(nèi)相應(yīng)的荷瘤模型,以克唑替尼(100mg/kg·d)為陽性對照,觀察給藥后不同劑量下法米替尼組(2.5,5,10,20mg/kg·d)的體內(nèi)抑瘤效果。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,克唑替尼和法米替尼中高劑量均能顯著性地抑制腫瘤生長(P0.01),表明法米替尼也可能對EML4-ALK突變的NSCLC生長具有良好的抑制作用,且呈劑量依賴的趨勢。但后期克唑替尼和法米替尼均產(chǎn)生耐藥情況,高劑量組法米替尼的效果優(yōu)于克唑替尼,表明后期仍需進一步開展法米替尼對EML4-ALK二次突變耐藥的相關(guān)研究。4.建立超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass,UHPLC-MS/MS)方法同時檢測人體血漿中法米替尼原型及主要代謝產(chǎn)物(M3、M7、M9-1和M9-5)并對臨床晚期腎癌的患者進行血藥濃度檢測,結(jié)合臨床患者的基本信息,療效及不良反應(yīng)發(fā)生情況進行法米替尼療效及不良反應(yīng)的相關(guān)性分析,結(jié)果表明法米替尼原型(M0)的血藥濃度與患者的獲益率相關(guān)(P0.05),法米替尼代謝產(chǎn)物M3的血藥濃度與與轉(zhuǎn)移灶累及器官數(shù)相關(guān)(P0.05),法米替尼代謝產(chǎn)物M9-1與手足綜合征的發(fā)生率相關(guān)(P0.05)。結(jié)論首次發(fā)現(xiàn)并驗證了法米替尼在細胞水平對EML4-ALK融合基因突變的NSCLC細胞具有顯著的抑制作用,初步闡明了法米替尼抑制EML4-ALK突變的NSCLC細胞的可能作用機制,即抑制ALK/Akt/ERK/STAT3腫瘤調(diào)控通路。通過體內(nèi)實驗進一步證實了法米替尼對其活性的抑制效果,后期還可圍繞法米替尼開展EML4-ALK二次突變導致耐藥的相關(guān)研究。本實驗中所建立的UHPLC-MS/MS方法可成功應(yīng)用于臨床樣本的檢測,并對晚期腎癌患者進行了血藥濃度的檢測,首次將其與療效及不良反應(yīng)進行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明法米替尼原型及代謝產(chǎn)物可能與療效及不良反應(yīng)發(fā)生率相關(guān),但后期仍需進一步考察驗證。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R965
【部分圖文】：

學碩士學位論文異性分析性分析通過 SPSS 21.0 進行處理，對凋亡率的比較采用 t 檢驗，P＜0.著性差異，P＜0.01 時認為有非常顯著差異。、 實驗結(jié)果） IC50值分析算（圖 1-1），法米替尼與克唑替尼對 NCI-H2228 腫瘤細胞的 IC50值 和 26.8 nM，說明法米替尼對 EML4-ALK 突變的細胞也有較好的抑

圖 1-2. 法米替尼對 NCI-H2228 細胞凋亡的抑制作用（n=3）左圖為給藥后細胞凋亡數(shù),其中右上、右下象限分別為后期凋亡和早期凋亡細胞比例；右圖法米替尼處理 48h 后細胞的凋亡率**比 P＜0.01（VS 空白對照組）（三） 法米替尼對 NCI-H2228 細胞周期的影響采用流式細胞儀檢測法米替尼對 NCI-H2228 細胞的周期影響，結(jié)果見圖 1-3。從圖中可以看出，經(jīng)法米替尼處理后，細胞周期變化比較顯著，與對照組相比，G0/G1期細胞比例顯著上升（P<0.05），比例高達 72.38%，G2 期細胞則顯著下降（P<0.01），比例僅為 1.2%，說明 NCI-H2228 細胞被法米替尼阻滯在 G0/G1 期。（四） 法米替尼對 NCI-H2228 細胞遷移能力的影響通過細胞劃痕實驗檢測法米替尼處理后 NCI-H2228 細胞的遷移能力，結(jié)果見圖

圖 1-3 法米替尼對 NCI-H2228 細胞周期的影響（n=3）左圖為給藥后細胞周期測定原始數(shù)據(jù)，右圖為給藥后的細胞周期分布情況，**P＜0.01（VS 空白對照組）
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本文編號：2888034