腸道菌群與肥胖等代謝綜合征發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系,但是高脂膳食調(diào)節(jié)腸道菌群及影響炎性反應的機制仍然不清楚。研究顯示,高脂膳食能夠引起機體氧化應激水平升高,尤其是引起腸道的氧化應激。而腸道是共生菌群棲息的環(huán)境,又由于不同的菌群氧化應激耐受性存在很大差異。因此,我們提出假設高脂膳食通過調(diào)節(jié)機體氧化還原狀態(tài)從而影響腸腔菌群結(jié)構(gòu)組成,使進入派伊爾結(jié)的內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,誘導腸道炎性細胞因子的產(chǎn)生,最終引起全身性炎癥反應及代謝綜合征的發(fā)生。 首先,高脂膳食誘導小鼠產(chǎn)生氧化應激模型及硫辛酸(LA)干預調(diào)節(jié),來研究腸道氧化還原狀態(tài)對菌群結(jié)構(gòu)的影響。通過檢測結(jié)腸,結(jié)腸內(nèi)容物自由基(ROS)、丙二醛(MDA)、總抗(T-AOC)水平評價腸道氧化還原狀態(tài);采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)及平板計數(shù)分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量。高脂膳食導致結(jié)腸,結(jié)腸內(nèi)容物中ROS、MDA顯著上升,T-AOC水平顯著下降,添加LA后,能顯著降低高脂膳食引起的氧化應激。DGGE結(jié)果顯示,高脂膳食導致腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂,出現(xiàn)高脂組特異性菌群,并且大腸桿菌、糞球菌數(shù)量顯著增加,乳酸菌數(shù)量顯著降低(P0.05)。LA處理后,菌群結(jié)構(gòu)有所改善,大腸桿菌、糞球菌數(shù)量顯著下降,乳酸菌數(shù)量顯著增加。相關性分析顯示,ROS、MDA水平與大腸桿菌、糞球菌數(shù)量顯著正相關(P0.05),與乳酸菌顯著負相關(P0.05)。T-AOC與乳酸菌顯著正相關,但與大腸桿菌、糞球菌顯著負相關(P0.05)。 高脂膳食建立肥胖易感和肥胖抵抗兩種模型,及白藜蘆醇(RES)干預進一步評價氧化應激與腸道菌群間的關系。采用熒光原位雜交(FISH)與流式細胞相結(jié)合的方法分析腸道菌群,并對結(jié)腸炎性基因表達情況進行評價。結(jié)果顯示,氧化應激水平:肥胖易感組肥胖抵抗組正常組,添加RES后,,能顯著降低各組氧化應激水平。FISH及主成分分析顯示正常組、肥胖易感組、肥胖抵抗組三組腸道菌群存在顯著差異。肥胖易感組乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著下降,腸桿菌屬數(shù)量顯著上升。擬桿菌與硬壁菌的比值:肥胖易感組肥胖抵抗組正常組,添加RES后,乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著上升,腸桿菌屬數(shù)量顯著下降,擬桿菌與硬壁菌的比值顯著改善。相關性分析顯示,擬桿菌與硬壁菌門的比值與ROS、MDA顯著負相關(P0.05),與T-AOC顯著正相關(P0.05)。肥胖易感組能顯著增強NOD2和CARD9的表達,并選擇性地激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,增強IL-8、IL-10、TNF-α、IL-23等細胞因子的分泌,引起機體嚴重炎癥反應。 研究高脂膳食誘導的肥胖易感和肥胖抵抗型小鼠派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)組成,及其對腸道炎癥的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組和肥胖抵抗組相比,肥胖易感組派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群豐度及多樣性顯著下降(P0.05)。正常組、肥胖抵抗組、肥胖易感組派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群種屬水平上差異顯著,表現(xiàn)為:肥胖易感組乳球菌屬(Lactococcus)、根瘤菌屬(Rhizobium)豐度顯著升高(P0.05),而Allobaculum和乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度顯著下降(P0.05)。另外,還有一些內(nèi)生菌屬,如鏈球菌屬(Streptococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、從毛單胞菌屬(Comamonas)和黃桿菌屬(Flavobacterium),高脂膳食后,無論是肥胖易感組還是肥胖抵抗組都顯著增加。另外,肥胖易感型小鼠顯著上調(diào)派伊爾結(jié)炎性細胞因子IL-6、TNF-α、INF-γ及IL-12的表達,其中IL-6、TNF-α與乳球菌屬、根瘤菌屬等呈顯著正相關,顯著抑制抗炎性細胞因子IL-10及TGF-β的表達(P0.05),其中IL-10與Allobaculum屬及乳桿菌屬呈顯著正相關。 對派伊爾結(jié)內(nèi)生乳桿菌結(jié)構(gòu)組成及其體外抗氧化特性進行研究。平板培養(yǎng)分離得到的92株乳桿菌經(jīng)ERIC-PCR分型后,共得到13種不同的圖譜,主要分屬于羅伊乳桿菌等五個種,其中羅伊乳桿菌得到8株。體外抗氧化實驗結(jié)果顯示,肥胖易感組氧化應激耐受性弱的羅伊乳桿菌數(shù)量顯著下降,氧化應激耐受性強的羅伊乳桿菌數(shù)量增加。其中Lactobacillus reuteri L8氧化應激耐受性最強,只存在于高脂組,為高脂組特異羅伊乳桿菌,而Lactobacillus reuteri L3氧化應激耐受性最弱,高脂組中消失,為正常組特異羅伊乳桿菌。并且L3能夠促進派伊爾結(jié)抗炎性細胞因子IL-10的產(chǎn)生,抑制炎性細胞因子IL-6、IL-12、TNF-α的產(chǎn)生,而且對LPS損傷的派伊爾結(jié)細胞有保護作用。 最后,研究兩株組特異性Lactobacillus reuteri L3和L8對機體代謝的影響。結(jié)果顯示,高脂組灌胃Lactobacillus reuteri L3,能顯著抑制高脂膳食引起的體重、血糖、血胰島素水平的增加,但此效果與抑制食物攝入量無關。高脂組灌胃Lactobacillus reuteri L3后,能顯著降低血LPS及炎性細胞因子的水平,而促進抗炎性細胞因子的分泌,另外,灌胃Lactobacillus reuteri L3后,通過下調(diào)肝臟中LPL及Scd1表達,上調(diào)Cyp7a1基因表達,促進肝臟組織中脂肪酸分解,并通過下調(diào)脂肪組織中PPAR-γ、ACC1和Fas的表達情況,抑制脂肪組織中脂肪酸合成。但高脂灌胃Lactobacillus reuteri L8后,對高脂膳食的改善效果不顯著。 綜上所述,高脂膳食通過誘導氧化應激導致腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂,使進入派伊爾結(jié)的內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,誘導腸炎性細胞因子的產(chǎn)生,并通過血液內(nèi)毒素等引起機體炎癥,最終導致肥胖等代謝綜合征的發(fā)生。
【學位授予單位】:江南大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2014
【分類號】:R151
文章目錄
摘要
Abstract
目錄
第一章 緒論
1.1 高脂膳食與腸道氧化應激
1.2 高脂膳食與腸道菌群
1.2.1 腸道菌群結(jié)構(gòu)組成
1.2.2 腸道菌群與機體代謝
1.2.3 高脂膳食對腸道菌群的影響
1.2.4 益生菌對機體健康的影響
1.2.5 研究腸道菌群的分子生物學技術
1.3 氧化應激與腸道菌群
1.3.1 氧化應激對腸道菌群的影響
1.3.2 腸道菌群對氧化應激的耐受性
1.4 慢性炎癥與機體代謝
1.5 本論文的研究背景及研究內(nèi)容
1.5.1 論文的研究背景
1.5.2 論文的研究內(nèi)容
第二章 高脂膳食及硫辛酸干預對腸道氧化應激及菌群的影響
2.1 前言
2.2 實驗材料
2.2.1 試驗主要材料
2.2.2 試驗主要試劑
2.2.3 主要溶液的配置
2.2.4 試驗主要設備
2.3 實驗方法
2.3.1 體外評價氧化應激對菌群的影響
2.3.2 動物喂養(yǎng)及組織樣品采集
2.3.3 組織樣品采集
2.3.4 指標測定
2.3.5 結(jié)腸內(nèi)容物總 DNA 提取
2.3.6 結(jié)腸內(nèi)容物菌群 PCR 擴增
2.3.7 變性梯度凝膠電泳
2.3.8 基因登錄號
2.3.9 數(shù)據(jù)分析
2.4 結(jié)果與討論
2.4.1 體外評價氧化應激對菌群的影響
2.4.2 高脂膳食及添加硫辛酸對機體健康表型的影響
2.4.3 硫辛酸緩解高脂膳食誘導的氧化應激水平
2.4.4 DGGE 技術及平板計數(shù)分析飲食對腸道菌群的影響
2.4.5 氧化應激與腸道菌群的相關性分析
2.5 本章小結(jié)
第三章 高脂膳食及白藜蘆醇干預對肥胖易感和肥胖抵抗小鼠腸道氧化應激及菌群的影響
3.1 前言
3.2 實驗材料
3.2.1 試驗主要材料
3.2.2 試驗主要試劑
3.2.3 主要溶液的配置
3.2.4 試驗主要設備
3.3 實驗方法
3.3.1 動物喂養(yǎng)
3.3.2 組織樣品采集
3.3.3 指標測定
3.3.4 數(shù)據(jù)分析
3.4 結(jié)果與討論
3.4.1 各組間機體健康表型的差異
3.4.2 肥胖易感和肥胖抵抗小鼠腸道氧化應激水平
3.4.3 熒光原位雜交結(jié)合流式細胞術分析腸道菌群組成
3.4.4 腸道氧化應激與腸道菌群相關性分析
3.4.5 肥胖易感及肥胖抵抗小鼠腸道炎癥水平
3.5 本章小結(jié)
第四章 肥胖易感及肥胖抵抗小鼠派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的研究
4.1 前言
4.2 實驗材料
4.2.1 實驗主要材料
4.2.2 實驗主要試劑
4.2.3 主要溶液的配制
4.2.4 實驗主要設備
4.3 實驗方法
4.3.1 動物喂養(yǎng)及樣品采集
4.3.2 454 高通量測序測定派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)組成
4.3.3 熒光定量 PCR 對派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的驗證分析
4.3.4 派伊爾結(jié)炎癥相關基因表達的分析
4.3.5 數(shù)據(jù)分析
4.4 結(jié)果與討論
4.4.1 高脂膳食對體重、能量攝入及血糖水平的影響
4.4.2 序列有效性、豐度、多樣性分析
4.4.3 基于門屬水平上派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的分析
4.4.4 基于多元統(tǒng)計派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的分析
4.4.5 基于熒光定量 PCR 對派伊爾結(jié)內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的驗證分析
4.4.6 基于熒光定量 PCR 對派伊爾結(jié)炎癥相關基因表達的分析
4.5 本章小結(jié)
第五章 派伊爾結(jié)內(nèi)生乳桿菌及優(yōu)勢菌羅伊乳桿菌的體外分析
5.1 前言
5.2 實驗材料
5.2.1 主要實驗材料
5.2.2 主要實驗試劑
5.2.3 主要溶液配制方法
5.2.4 實驗主要設備
5.3 實驗方法
5.3.1 派伊爾結(jié)內(nèi)生乳桿菌的分離
5.3.2 派伊爾結(jié)內(nèi)生羅伊乳桿菌定量分析
5.3.3 羅伊乳桿菌抗氧化活性的體外分析
5.3.4 羅伊乳桿菌調(diào)節(jié)派伊爾結(jié)細胞細胞因子水平的體外分析
5.3.5 羅伊乳桿菌 L3 對派伊爾結(jié)細胞的保護作用
5.3.6 統(tǒng)計分析
5.4 結(jié)果與討論
5.4.1 派伊爾結(jié)內(nèi)生乳桿菌分離結(jié)果
5.4.2 ERIC-PCR 指紋圖譜結(jié)果
5.4.3 羅伊乳桿菌抗氧化活性的體外分析
5.4.4 羅伊乳桿菌調(diào)節(jié)派伊爾結(jié)細胞細胞因子水平的體外分析
5.4.5 羅伊乳桿菌 L3 對派伊爾結(jié)細胞的保護調(diào)節(jié)
5.5 本章小結(jié)
第六章 灌胃兩種不同的羅伊乳桿菌對機體代謝的影響
6.1 前言
6.2 實驗材料
6.2.1 實驗主要材料
6.2.2 主要實驗試劑
6.2.3 主要溶液配制方法
6.2.4 實驗主要設備
6.3 實驗方法
6.3.1 羅伊乳桿菌的活化與培養(yǎng)
6.3.2 動物實驗
6.4 結(jié)果與討論
6.4.1 灌胃兩種羅伊乳桿菌對機體健康表型的影響
6.4.2 兩種羅伊乳桿菌對氧氣消耗量、呼吸交換率、能量攝入及活動的影響
6.4.3 灌胃兩種羅伊乳桿菌對內(nèi)毒素的影響
6.4.4 灌胃兩種羅伊乳桿菌對細胞因子的影響
6.4.5 灌胃兩種羅伊乳桿菌對肝臟組織的影響
6.4.6 灌胃兩種羅伊乳桿菌對脂肪組織的影響
6.5 本章小結(jié)
主要結(jié)論與展望
論文主要結(jié)論
展望
論文主要創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄
作者在攻讀博士學位期間發(fā)表
【參考文獻】
相關期刊論文 前4條
1 ;Role of nitric oxide and peroxynitrite anion in lung injury induced by intestinal ischemia-reperfusion in rats[J];World Journal of Gastroenterology;2003年06期
2 ;Risk factors of development of gut-derived bacterial translocation in thermally injured rats[J];World Journal of Gastroenterology;2004年11期
3 Julio M Mayol;Yolanda Adame-Navarrete;Pilar Alarma-Estrany;Elena Molina-Roldan;Fernando Huete-Toral;Jesus A Fernandez-Represa;;Luminal oxidants selectively modulate electrogenic ion transport in rat colon[J];World Journal of Gastroenterology;2006年34期
4 Reena Kumari;Vineet Ahuja;Jaishree Paul;;Fluctuations in butyrate-producing bacteria in ulcerative colitis patients of North India[J];World Journal of Gastroenterology;2013年22期
本文編號:
2126496
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