發(fā)布時間：2020-11-17 11:06

　　 伏馬菌素(Fumonisins)是以串珠鐮刀菌(Fusarium verticillioides)和再育鐮刀菌(F.proliferatum)為主的致病菌產(chǎn)生的真菌毒素,嚴(yán)重污染玉米、高粱、水稻等多種糧食作物及其產(chǎn)品。伏馬菌素可引起人、畜中毒,具有潛在的致癌性,其中伏馬菌素B1(FB1)已被國際癌癥研究機構(gòu)認(rèn)定為2B類致癌物。FDA和歐盟對食品和飼料中該毒素量規(guī)定嚴(yán)格的控制標(biāo)準(zhǔn)。因此,發(fā)展伏馬菌素的快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù),分析我國主要鐮刀菌的產(chǎn)毒類型,對于保障食品安全和人、畜健康具有重要意義。黃曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的黃曲霉毒素,具有強烈的致癌和致畸作用,已被國際癌癥研究中心認(rèn)定為I類致癌物。在我國黃曲霉菌是形成黃曲霉毒素的主要真菌。黃曲霉菌特異抗體既可用于免疫檢測產(chǎn)毒菌,也可用于防治或消除黃曲霉菌及其毒素。因此,表達(dá)、分析基于我國代表性黃曲霉菌菌株篩選的特異抗體,將為進(jìn)一步有效利用這些抗體提供資料。本實驗圍繞伏馬菌素免疫及化學(xué)檢測和黃曲霉菌特異抗體表達(dá)開展了研究,取得的主要結(jié)果如下:1.以鐮刀菌種群特異引物分子鑒定分離的溫暖鐮刀菌(F.temperatum)、膠孢鐮刀菌(F.subglutinans)和串珠鐮刀菌(F.verticillioides)的菌種類型,同時以毒素合成關(guān)鍵基因為靶位點,對3種鐮刀菌的產(chǎn)毒類型進(jìn)行了分子檢測。結(jié)果表明,串珠鐮刀菌具有伏馬菌素的產(chǎn)毒基因,而溫暖鐮刀菌和膠孢鐮刀菌沒有該基因。2.在玉米培養(yǎng)基中接種3種不同類型的鐮刀菌,用于檢測菌株的產(chǎn)毒類型和產(chǎn)毒量。利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)對毒素進(jìn)行化學(xué)檢測,結(jié)果表明串珠鐮刀菌可以產(chǎn)生伏馬菌素,而溫暖鐮刀菌和膠孢鐮刀菌不能產(chǎn)生。此外,利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)對毒素進(jìn)行免疫學(xué)檢測,結(jié)果與化學(xué)檢測一致,同時這兩項檢測結(jié)果與分子檢測具有很好的一致性。結(jié)合分子檢測、化學(xué)檢測及免疫學(xué)檢測結(jié)果,表明在這3種類型的鐮刀菌中,只有串珠鐮刀菌是伏馬菌素的產(chǎn)生菌。3.將兩個對黃曲霉菌細(xì)胞壁蛋白親和力較強的單鏈抗體(sc Fv3和sc Fv12),通過3中不同的連接短肽(218linker,G4S,(G4S)3)構(gòu)建二聚體抗體,并進(jìn)行原核生物過量表達(dá)和親和層析純化。SDS-PAGE電泳和Western blot分析表明,三種二聚體抗體均可在原核表達(dá)體系中表達(dá),為大量制備抗體用于黃曲霉菌檢測分析打下了基礎(chǔ)。4.利用抗菌肽(MSI99和AFP2)和抗黃曲霉細(xì)胞壁蛋白單鏈抗體(sc Fv3和sc Fv12)構(gòu)建了8種不同組合的植物表達(dá)載體,其中包括以抗菌肽或單鏈抗體單獨構(gòu)建的載體以及抗菌肽-單鏈抗體融合基因的載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana),成功獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株,通過溫室加代及各世代分子鑒定,已培養(yǎng)至T3代。5.利用半定量PCR方法對轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代陽性植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的鑒定,結(jié)果表明,抗菌肽、單鏈抗體及其抗菌肽-單鏈抗體融合基因在T3代植株中均可被轉(zhuǎn)錄。還探索了擬南芥離體葉片接種黃曲霉菌孢子的方法,發(fā)現(xiàn)黃曲霉孢子可以侵染擬南芥葉片,但不能擴(kuò)展。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S859.8;R114
【部分圖文】：

1.1.2 伏馬菌素生物合成相關(guān)基因伏馬菌素是一類水溶性的真菌毒素，具有致畸致癌的作用，存在于多種作物及食品飼料中，對人類的健康存在巨大的威脅。研究發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)生伏馬菌素是由產(chǎn)毒基因遺傳的（Desjardins et al 1992）。伏馬菌素生物合成的具體機制并不清楚但與其合成相聯(lián)系的 17 個基因處于同一基因族。其中多肽酮合成酶（PKS）由 fu基因編碼，fum1 是調(diào)控伏馬菌素合成的所必需的，fum1 基因缺失或者失活，導(dǎo)致株無法合成伏馬菌素，而其他基因失活導(dǎo)致部分毒素?zé)o法合成、毒素種類改變或素含量降低。在串珠鐮刀菌研究中，現(xiàn)已對部分 fum1 基因功能進(jìn)行了大膽預(yù)測和證（Alexander et al 2009）。因此很多研究從分子水平上，以是否還有 fum1 基因來為判斷菌株產(chǎn)伏馬菌素的標(biāo)準(zhǔn)。1.1.3 伏馬菌素的毒理研究圖 1 伏馬菌素 B 類的化學(xué)結(jié)構(gòu)（Lazzaro et al 2012）Fig.1 Chemical structure of B-series fumonisins（Lazzaro et al 2012）

3 結(jié)果與分析3.1 伏馬菌素的檢測3.1.1 菌株鑒定3.1.1.1 菌株形態(tài)觀察3 種類型的菌株的孢子液調(diào)整濃度為 5×105個/mL，每個菌株取 10 μL 接種至PDA 培養(yǎng)皿（直徑為 9 cm）中央，28 ℃恒定溫度條件倒置培養(yǎng) 5 d 后觀察菌株形態(tài)，結(jié)果如圖 2 所示。圖中編號 A-E 為溫暖鐮刀菌，F(xiàn)-G 為膠孢鐮刀菌，H-J 為串珠鐮刀菌，所有菌株均為本實驗室從田間小麥、玉米分離得到。圖中所有菌株菌絲較為稀疏，尤其是溫暖鐮刀菌菌株。其中溫暖鐮刀菌氣生菌絲較少，貼壁生長，產(chǎn)生淡紫色或淺粉色的色素，而串珠鐮刀菌菌株（H-J）的菌絲生長較快、相對厚實，產(chǎn)生紫色色素。膠孢鐮刀菌菌株生長速度介于他們兩者之間，產(chǎn)淡紫色色素。

1 均能擴(kuò)增出預(yù)期大小片段，而引物 FUM1-F-菌株中擴(kuò)增出條帶，另外兩種菌株沒有目的條因，所以我們確定只有串珠鐮刀菌菌株具有產(chǎn)株沒有該基因，推測其可能不能產(chǎn)生伏馬菌素AM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10圖 3 菌株種類鑒定Fig.3 Identification of strains species marker；泳道 1：M18059；泳道 2：M18061；泳道 3：M18063道 6：M16084；泳道 7：M20020；泳道 8：M5332；泳道 9：Ger; Lane 1: M18059; Lane 2: M18061; Lane 3: M18063; Lane 6: M16084; Lane 7: M20020; Lane 8: M5332; Lane 9: GLOX;bp－
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 田長恩,王正詢,陳韜,周玉萍,黃自然,黃亞東;抗菌肽D基因?qū)�入番茄及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定[J];遺傳;2000年02期

2 賈士榮,屈賢銘,馮蘭香,唐惕,唐益雄,劉坤,趙艷麗,白永延,蔡敏鶯;轉(zhuǎn)抗菌肽基因提高馬鈴薯對青枯病的抗性[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);1998年03期

3 方宏筠,王關(guān)林,王火旭,賈士榮,董云洲,唐益雄;抗菌肽基因轉(zhuǎn)化櫻桃矮化砧木獲得抗根瘤病的轉(zhuǎn)基因植株[J];植物學(xué)報;1999年11期

本文編號：2887431