發(fā)布時間：2020-10-28 06:59

　　 目的:調(diào)查骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)移植調(diào)控2,5-己二酮(HD)中毒大鼠神經(jīng)組織NGF表達的分子機制。為闡明BMSCs移植對HD中毒大鼠神經(jīng)組織損傷的修復(fù)機制提供依據(jù)。方法:選用無特定病原體(specified pathogen free,SPF)級別的100只4-6周雄性SD大鼠,隨機分為:正常對照組(Control)、干細胞對照組(BMSCs)、染毒組(HD)、自身修復(fù)組(HD-NS)、干細胞修復(fù)組(HD-BMSCs),每組20只。以濃度為0.9%的無菌生理鹽水將2,5-己二酮稀釋,對大鼠進行腹腔注射染毒。染毒組的劑量為400 mg/kg,注射量為0.3 ml/100 g,對照組給予同等劑量的無菌生理鹽水。每個工作日的特定時間染毒1次,染毒周期為5周。染毒模型成功后,干細胞修復(fù)組經(jīng)鼠尾靜脈注射BMSCs,自身修復(fù)組給予相同劑量無菌生理鹽水。干細胞修復(fù)5周后,每組動物分別提取血清、坐骨、脊髓等組織并置于-80℃深凍冰箱中低溫保存。運用ELISA方法測定各組大鼠血清、脊髓和坐骨中NGF濃度,q RT-PCR和Western Blotting方法測定各組脊髓、坐骨中NGF表達;mi RNA微陣列芯片發(fā)現(xiàn)mi RNA Let-7家族在各組變化明顯,差異倍數(shù)顯著,應(yīng)用q RT-PCR在各組坐骨、脊髓及VSC 4.1細胞對其進行驗證,并發(fā)現(xiàn)Let-7e-5p差異變化最為明顯;利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將化學(xué)合成的Let-7e-5p mimic、Let-7e-5p inhibitor的陰性對照序列及NGF si RNA 2分別轉(zhuǎn)染進VSC 4.1細胞中,應(yīng)用q RT-PCR、Western Blotting方法檢測VSC 4.1細胞經(jīng)處理后NGF的表達水平。數(shù)據(jù)分析選用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件,結(jié)果選用Graph Pad Prism 5作圖軟件。結(jié)果:1.ELISA方法測定各組血清中NGF濃度結(jié)果顯示,Control組NGF濃度為263 ng/ml;HD中毒組NGF濃度為136 ng/ml,低于Control組(p0.05);BMSCs修復(fù)組NGF濃度為187 ng/ml,高于HD中毒組(p0.05)。2.ELISA方法測定各組脊髓神經(jīng)組織NGF濃度結(jié)果顯示,Control組NGF濃度為397 ng/ml;HD中毒組NGF濃度為176 ng/ml,低于Control組(p0.05);BMSCs修復(fù)組NGF濃度為368 ng/ml,高于HD中毒組(p0.05)。q RT-PCR、Western Blotting方法檢測各組脊髓神經(jīng)組織NGF基因、蛋白表達結(jié)果顯示,HD中毒組NGF表達顯著低于Control組(p0.05);BMSCs修復(fù)組NGF表達高于HD中毒組(p0.05)。3.ELISA方法測定各組坐骨神經(jīng)組織NGF濃度結(jié)果顯示,Control組NGF濃度為201 ng/ml;HD中毒組NGF濃度為134 ng/ml,低于Control組(p0.05);BMSCs修復(fù)組NGF濃度為163 ng/ml,高于HD中毒組(p0.05)。q RT-PCR、Western Blotting方法檢測各組坐骨神經(jīng)組織NGF基因、蛋白表達結(jié)果顯示,HD中毒組NGF表達顯著低于Control組(p0.05);BMSCs修復(fù)組NGF表達高于HD中毒組(p0.05)。4.q RT-PCR結(jié)果顯示,Let-7e-5p在各組坐骨、脊髓及VSC 4.1細胞中表達水平明顯高于其他mi RNA Let-7家族(p0.01)。5.將Let-7e-5p mimic、inhibitor轉(zhuǎn)染進VSC 4.1細胞,q RT-PCR與Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染Let-7e-5p mimic組的VSC 4.1細胞中NGF含量降低;轉(zhuǎn)染Let-7e-5p inhibitor組的VSC 4.1細胞中NGF含量升高(p0.05)。6.敲除NGF后,細胞中NGF含量有所降低。7.將Let-7e-5p mimic、inhibitor及NGF si RNA 2轉(zhuǎn)染進VSC4.1細胞后,q RT-PCR與Western Blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn),Let-7e-5p mimic+NGF si RNA 2組的VSC4.1細胞中NGF含量降低;Let-7e-5p inhibitor+NGF si RNA 2組的VSC 4.1細胞中NGF含量升高。結(jié)論:BMSCs移植顯著提高HD中毒大鼠血清NGF濃度。BMSCs移植上調(diào)HD中毒大鼠脊髓、坐骨神經(jīng)組織NGF表達。BMSCs移植下調(diào)HD中毒大鼠脊髓、坐骨神經(jīng)組織mi RNA Let-7家族部分亞型。BMSCs介導(dǎo)mi RNA Let-7家族部分亞型負調(diào)控HD中毒大鼠神經(jīng)組織內(nèi)源性NGF表達。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

各組大鼠脊髓神經(jīng)組織NGF濃度

各組大鼠脊髓神經(jīng)組織NGF基因表達

24為了驗證脊髓神經(jīng)組織的基因表達，用 Western Blotting 檢測 NGF 蛋白表達結(jié)果如圖4所示，HD中毒組NGF表達顯著低于Control組（p <0.05）；BMSCs修復(fù)組 NGF 表達高于 HD 中毒組（p <0.05）。圖 4 各組大鼠脊髓神經(jīng)組織 NGF 蛋白表達注：*為與 Control 組相比 p <0.05，#為與 HD 中毒組相比 p <0.05.3. BMSCs 移植對 HD 中毒大鼠坐骨神經(jīng)組織 NGF 水平的影響坐骨神經(jīng)組織 NGF 濃度如圖 5 所示，Control 組 NGF 濃度為 201 ng/ml；HD 中毒組 NGF 濃度為 134 ng/ml，低于 Control 組（p <0.05）；BMSCs 修復(fù)組 NGF 濃度為 163 ng/ml，高于 HD 中毒組（p <0.05）。
【參考文獻】

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本文編號：2859757