發(fā)布時間：2020-03-21 14:17

【摘要】：豐城雞血藤(Millettia Nitida Benth.var.Hirsutissima Z.Wei)是我國南方地區(qū)使用的一味傳統(tǒng)中藥材,藥用部位是干燥藤莖。主要產(chǎn)自江西、福建、廣東、廣西和湖南。在臨床上具有活血、補血、通絡,主治肢體麻木、癱瘓、腰膝酸痛、月經(jīng)不調(diào)、癱瘓的功效,豐城雞血藤中主要以黃酮類成分發(fā)揮其生物活性作用,有抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。在漫長的用藥歷史中,雖然豐城雞血藤的有效性及可靠性得到了充分的驗證,但現(xiàn)代研究非常匱乏。為推進該品種的現(xiàn)代化發(fā)展,獲取新型抗類風濕性關節(jié)炎有效藥物,對豐城雞血藤抗類風濕性關節(jié)炎物質(zhì)基礎及活性成分的研究非常必要。目的采用液質(zhì)聯(lián)用技術對豐城雞血藤二氯甲烷提取物中化學成分的鑒定,考察該部位的體內(nèi)抗類風濕性關節(jié)炎藥效學作用,闡明豐城雞血藤抗類風濕性關節(jié)炎作用的物質(zhì)基礎和抗炎作用機制。應用體外細胞模型,考量豐城雞血藤二氯甲烷部位和7個單體化合物對人類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞的增殖影響。方法1.采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法,對豐城雞血藤二氯甲烷提取物中化學成分進行鑒定,明確該部位中的主要化學組成。逑2.體內(nèi)實驗:建立牛Ⅱ型膠原誘導型關節(jié)炎(CIA)大鼠模型,將60只SD大鼠隨機分為6組,空白組、模型組、甲氨蝶呤組、豐城雞血藤二氯甲烷高劑量(220mg/kg),豐城雞血藤二氯甲烷中劑量組(110mg/kg),豐城雞血藤二氯甲烷低劑量(55mg/kg),豐城雞血藤給藥組連續(xù)灌胃35天。甲氨蝶呤組劑量為1mg/kg,每周灌胃一次,模型對照組、正常對照組不給予特殊藥物處理。在治療過程中每周對所有大鼠進行活動狀態(tài)、AI指數(shù)、體重改變及足趾腫脹進行觀察,并記錄。給藥結(jié)束后,各組大鼠腹主動脈取血,收集好血清,稱重大鼠的胸腺和脾臟,于4%多聚甲醛中固定大鼠后肢踝關節(jié)和肝臟組織。用ELISA法測定各組大鼠血清中促炎因子IL-1β和TNF-α的含量,并進行大鼠關節(jié)及肝臟病理切片觀察。3.體外實驗:研究從豐城雞血藤中分離得到的部分化合物對人類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞(RA-FLS)的增殖作用,用不同濃度的7個單體化合物、豐城雞血藤二氯甲烷部位提取物和甲氨蝶呤分別作用于體外培養(yǎng)的RA-FLS細胞,采用CCK-8比色法檢測該細胞增殖的情況,進行抗類風濕性關節(jié)炎的活性評價。結(jié)果1.本研究采用UPLC-Q-TOF-MS-MS法,根據(jù)化合物精確分子量、計算分子式,結(jié)合二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),參照對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律,在參考文獻的指導下,從豐城雞血藤二氯甲烷提取物中鑒定出34個化合物,其中26個黃酮類化合物,有機酸類化合物3個,香豆素類化合物1個,蒽醌類化合物2個,三萜類化合物1個,甾體類化合物1個。逑2.牛Ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑造模的CIA大鼠,在加強免疫后第3天開始出現(xiàn)關節(jié)紅腫,觀察AI指數(shù)評分、足趾腫脹,空白組與模型組相比較,有統(tǒng)計學差異,說明模型建立成功。3.在CIA大鼠發(fā)病過程中,促炎因子的表達明顯升高,模型組大鼠血清中的促炎因子IL-1β、TNF-α的分泌明顯高于空白組(P0.01),豐城雞血藤二氯甲烷提取物能下調(diào)IL-1β,TNF-α的分泌,其中220mg/kg對IL-1β,TNF-α的抑制作用與M TX相當,而低劑量雖能降低炎性因子的表達,但無顯著差異。4.豐城雞血藤二氯甲烷提取物對CIA大鼠病情有治療作用,明顯抑制大鼠足趾腫脹,減少關節(jié)滑膜炎性浸潤及纖維增生等炎癥反應,并能在一定程度上恢復其免疫能力,是潛在的抗風濕有效部位,CIA模型大鼠的肝臟病理與正常大鼠無明顯異常。5.對豐城雞血藤中分離得到的部分單體化合物(刺芒柄花素、染料木素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、印度黃檀苷、大豆黃素、表羽扇豆醇)和豐城雞血藤二氯甲烷部位進行抗類風濕性關節(jié)炎活性篩選測試結(jié)果顯示:陽性對照組細胞增值率均小于空白組且差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),證明甲氨蝶呤作為陽性對照藥物符合本實驗。除表羽扇豆醇化合物外,其余均在一定程度上對RA-FLS細胞的增殖具有抑制作用(P0.05或P0.01)。其中,豐城雞血藤二氯甲烷提取物、刺芒柄花素、染料木素、芒柄花苷的IC50值較小,對滑膜細胞增殖有顯著的抑制效果,提示具有較好的抗RA活性。而大豆黃素、毛蕊異黃酮、印度黃檀苷三個化合物的IC50值在最大給藥濃度以上。染料木素在本實驗設定給藥濃度范圍內(nèi),對滑膜細胞增殖的抑制效果隨給藥濃度的增加而提升,具有一定的劑量依賴性。在單體化合物中染料木素的抗RA效果最為理想(具有較高的細胞增殖抑制效果和較低的IC50值)。結(jié)論豐城雞血藤二氯甲烷部位具有較好的體內(nèi)抗類風濕關節(jié)炎作用,是通過抑制CIA大鼠血清中促炎因子TNF-α和IL-1β的表達來發(fā)揮其作用,是一個有潛力的抗類風濕性關節(jié)炎候選藥物。豐城雞血藤中抑制RA-FLS細胞增殖的有效成分是黃酮類化合物,主要是刺芒柄花素、染料木素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、印度黃檀苷、大豆黃素等活性成分發(fā)揮作用。
【圖文】：

圖 1 異黃酮的基本母核Fig.1 basic maternal nucleus of isoflavone 2 其他黃酮類型化合物名稱及取代基情 names and substituents of other types of fla物名稱 化合苷 R8=O素(naringenin) R5=R草素(luteolin) R3′=′,4′-trihydroxyflavonevitexinR7=RR5=R)-5,7,3′,5′-tetrahydroxyflavanone 素(Liquiritigenin) R7=R,3′,4′-tetrahydroxyflavanone R3=R′,4′-trihydroxyflavanone R7=R

3′-dihydroxy-6,4′-methoxyflavan 查爾酮類18 紫鉚花素(Butein) R1=OH,R2=OH 19 異甘草素(Isoliquiritigenin) R1=H,R2=OH 20 3, 2′, 4′, -Trihydroxy-4-methoxychalcone R1=OH,R2=OCH3紫檀烷類 21 （-）-高麗槐素(maackiain)
【學位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2593458