發(fā)布時間：2020-03-21 17:00

【摘要】：目的:膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一種常見的膽道惡性腫瘤,惡性程度高,預(yù)后極差,約占消化道腫瘤中的3%,其發(fā)病率與死亡率逐年上升。目前膽管癌治療原則仍采用手術(shù)切除為主的綜合治療方案,但確診時僅有不足1/3的患者可行手術(shù)切除,且手術(shù)預(yù)后差,聯(lián)合化療對局部晚期或轉(zhuǎn)移性不可切除膽管癌效果也不理想,迫切需要開發(fā)新的多學(xué)科綜合治療手段和治療藥物,從而改善膽管癌患者的預(yù)后。姜黃素,中藥姜黃中提取的天然成分,具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種生物活性,但是由于其化學(xué)不穩(wěn)定及生物利用度低等缺點(diǎn),限制了其臨床應(yīng)用。本論文通過對姜黃素的不穩(wěn)定基團(tuán)改造,得到了化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物WZ26,并對WZ26進(jìn)行了初步的抗膽管癌藥理活性篩選,發(fā)現(xiàn)WZ26顯示出很好的抗膽管癌活性。因此本論文將進(jìn)一步深入的研究WZ26的體內(nèi)外抗膽管癌的作用及機(jī)制。方法:1、姜黃素類似物WZ26的體外抗腫瘤活性及機(jī)制研究以姜黃素為先導(dǎo)化合物,設(shè)計合成了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物WZ26,通過MTT法測定了化合物WZ26在三種不同膽管癌細(xì)胞株中的抗腫瘤活性,通過流式細(xì)胞儀研究了化合物WZ26在膽管癌細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡中的作用。通過Western-blotting法研究了WZ26對凋亡、周期相關(guān)蛋白Pro-caspase3、CDC和Cyclin B1的影響。通過Western-blotting、流式細(xì)胞儀和透射電鏡等方法,研究了WZ26對膽管癌細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡的作用是否與細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平有關(guān)。另外,還通過Western-blotting、侵襲和遷移等實(shí)驗(yàn)方法,探討了WZ26抗膽管癌細(xì)胞高侵襲性的機(jī)制。2、姜黃素類似物WZ26的體內(nèi)抗腫瘤活性及機(jī)制研究通過建立膽管細(xì)胞癌QBC-939細(xì)胞株的BALB/c A裸鼠皮下瘤模型,運(yùn)用Western-blotting、免疫組化、免疫熒光等手段來驗(yàn)證化合物WZ26體內(nèi)抗腫瘤藥理藥效及初步探討其作用機(jī)制。結(jié)果:一、姜黃素類似物WZ26的體外抗腫瘤活性及機(jī)制研究1、WZ26對膽管癌細(xì)胞(RBE、QBC-939、HUCCA)的半數(shù)抑制率IC50都較姜黃素小,即WZ26對膽管癌細(xì)胞生長的抑制活性較姜黃素好。2、WZ26劑量(5,10,20μM)依賴性地促進(jìn)膽管癌細(xì)胞株(RBE、QBC-939、HUCCA)凋亡,同時也誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。3、機(jī)制上WZ26通過升高QBC-939細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平,可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯,而ROS抑制劑NAC可以逆轉(zhuǎn)以上改變。4、通過JC-1免疫熒光方法,觀測到化合物WZ26加入后,由于線粒體膜電位的衰竭,熒光由紅色變成綠色。電鏡觀測線粒體的形態(tài)學(xué),看到WZ26作用后QBC-939細(xì)胞線粒體內(nèi)膜脊結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞導(dǎo)致線粒體腫脹,在超微結(jié)構(gòu)上證明線粒體膜發(fā)生破壞。5、用免疫熒光法檢測QBC-939細(xì)胞中細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)情況。結(jié)果顯示在WZ26(15μM)處理細(xì)胞24h后,細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中,紅色熒光從綠色熒光中擴(kuò)散出來。WZ26(15μM)處理24h后Caspase9的活性也明顯增加。6、Western blottingting結(jié)果顯示W(wǎng)Z26作用于QBC-939細(xì)胞后時間和劑量依賴性抑制了STAT3的激活。7、劃痕實(shí)驗(yàn),Transwell,PCR和Western blottingting結(jié)果說明WZ26可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的QBC-939細(xì)胞的遷移、浸潤和抑制TNF-α誘導(dǎo)的QBC-939細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。8、Western blottingting結(jié)果顯示W(wǎng)Z26還可抑制QBC-939細(xì)胞內(nèi)TNF-α和LPS誘導(dǎo)的STAT3通路的激活。二、姜黃素類似物WZ26的體內(nèi)抗腫瘤活性及機(jī)制研究研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)WZ26通過升高腫瘤組織內(nèi)活性氧水平,誘導(dǎo)線粒體損傷和細(xì)胞凋亡,明顯抑制小鼠QBC-939細(xì)胞皮下瘤生長。1、從體重和腫瘤數(shù)據(jù)可以看到,給藥組和對照組裸鼠的體重沒有明顯的差異,說明藥物對裸鼠基本無毒。從腫瘤體積圖中可以明顯看到,裸鼠給藥WZ26后,腫瘤體積減小,說明WZ26能夠抑制膽管癌QBC-939細(xì)胞生長。2、從Western blottingting結(jié)果可以看到,在腫瘤組織中促凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)增加,說明WZ26在體內(nèi)也能夠促進(jìn)膽管癌QBC-939細(xì)胞的凋亡。3、從免疫組化結(jié)果可以看到,與增殖相關(guān)的蛋白Ki67在給藥組表達(dá)減少,說明WZ26抑制了裸鼠體內(nèi)膽管癌QBC-939細(xì)胞的增殖。結(jié)論:本文通過對WZ26的體內(nèi)外抗膽管癌的作用及機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),WZ26一方面通過升高膽管癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激水平,從而激活線粒體凋亡通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期;另一方面通過抑制STAT3的磷酸化,抑制膽管癌細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而發(fā)揮抗膽管癌的作用。WZ26很有潛力成為膽管癌治療中的新一類候選藥物。同時,我們的研究也表明,靶向ROS水平和抑制炎癥因子的表達(dá)有可能成為治療膽管癌的重要策略。但是目前對該化合物作用靶點(diǎn)以及深入的抗膽管癌機(jī)制沒有十分明確,有待于進(jìn)一步探討。
【圖文】：

3.1 WZ26 的結(jié)構(gòu)和抑制膽管癌細(xì)胞的生存率通過對姜黃素的結(jié)構(gòu)改造，去除其不穩(wěn)定基團(tuán)，我們得到姜黃素單羰基類似物WZ26，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖 3-1A。以姜黃素為陽性對照，用 MTT 法檢測了 WZ26 對三種膽管癌細(xì)胞（RBE，QBC-939，HUCCA）生存率的影響。WZ26（濃度為 0.625，1.25，2.5，5，10，20μM）孵育膽管癌細(xì)胞 24 小時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 WZ26 可以劑量依賴性地降低膽管癌細(xì)胞的生存率，其中對測定的 RBE，QBC-939 和 HUCCA 細(xì)胞的 IC50 值分別為 4.7μM，4.8μM 和 4.2μM, 姜黃素對應(yīng) IC50 值分別為＞20μM，8.9μM和 10.8μM（圖 3-1-B-C）。這表明 WZ26 明顯抑制膽管癌細(xì)胞的生存率，作用效果要優(yōu)于姜黃素。同時，我們用 MTT 實(shí)驗(yàn)對 WZ26 的毒性做了評估，WZ26 對正常膽管上皮細(xì)胞（HIBEC）的 IC50 值＞20μM（圖 3-1-B），這進(jìn)一步表明 WZ26 可以選擇性的抑制膽管癌細(xì)胞的生存率，對正常細(xì)胞影響較小，安全性高。

WZ26誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯A.WZ26（5，，10和15μM）分別處理膽管癌細(xì)胞RBE，QBC-939，HUCCA細(xì)胞24HUCCAQBC-939
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285

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本文編號：2593646