發(fā)布時間：2020-03-21 17:00

【摘要】：目的:膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一種常見的膽道惡性腫瘤,惡性程度高,預后極差,約占消化道腫瘤中的3%,其發(fā)病率與死亡率逐年上升。目前膽管癌治療原則仍采用手術切除為主的綜合治療方案,但確診時僅有不足1/3的患者可行手術切除,且手術預后差,聯(lián)合化療對局部晚期或轉移性不可切除膽管癌效果也不理想,迫切需要開發(fā)新的多學科綜合治療手段和治療藥物,從而改善膽管癌患者的預后。姜黃素,中藥姜黃中提取的天然成分,具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多種生物活性,但是由于其化學不穩(wěn)定及生物利用度低等缺點,限制了其臨床應用。本論文通過對姜黃素的不穩(wěn)定基團改造,得到了化學性質穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物WZ26,并對WZ26進行了初步的抗膽管癌藥理活性篩選,發(fā)現(xiàn)WZ26顯示出很好的抗膽管癌活性。因此本論文將進一步深入的研究WZ26的體內外抗膽管癌的作用及機制。方法:1、姜黃素類似物WZ26的體外抗腫瘤活性及機制研究以姜黃素為先導化合物,設計合成了結構穩(wěn)定的單羰基姜黃素類似物WZ26,通過MTT法測定了化合物WZ26在三種不同膽管癌細胞株中的抗腫瘤活性,通過流式細胞儀研究了化合物WZ26在膽管癌細胞周期阻滯和誘導凋亡中的作用。通過Western-blotting法研究了WZ26對凋亡、周期相關蛋白Pro-caspase3、CDC和Cyclin B1的影響。通過Western-blotting、流式細胞儀和透射電鏡等方法,研究了WZ26對膽管癌細胞周期阻滯和誘導凋亡的作用是否與細胞內活性氧(ROS)水平有關。另外,還通過Western-blotting、侵襲和遷移等實驗方法,探討了WZ26抗膽管癌細胞高侵襲性的機制。2、姜黃素類似物WZ26的體內抗腫瘤活性及機制研究通過建立膽管細胞癌QBC-939細胞株的BALB/c A裸鼠皮下瘤模型,運用Western-blotting、免疫組化、免疫熒光等手段來驗證化合物WZ26體內抗腫瘤藥理藥效及初步探討其作用機制。結果:一、姜黃素類似物WZ26的體外抗腫瘤活性及機制研究1、WZ26對膽管癌細胞(RBE、QBC-939、HUCCA)的半數(shù)抑制率IC50都較姜黃素小,即WZ26對膽管癌細胞生長的抑制活性較姜黃素好。2、WZ26劑量(5,10,20μM)依賴性地促進膽管癌細胞株(RBE、QBC-939、HUCCA)凋亡,同時也誘導膽管癌細胞周期阻滯在G2/M期。3、機制上WZ26通過升高QBC-939細胞內活性氧(ROS)水平,可以誘導細胞凋亡和周期阻滯,而ROS抑制劑NAC可以逆轉以上改變。4、通過JC-1免疫熒光方法,觀測到化合物WZ26加入后,由于線粒體膜電位的衰竭,熒光由紅色變成綠色。電鏡觀測線粒體的形態(tài)學,看到WZ26作用后QBC-939細胞線粒體內膜脊結構發(fā)生破壞導致線粒體腫脹,在超微結構上證明線粒體膜發(fā)生破壞。5、用免疫熒光法檢測QBC-939細胞中細胞色素C由線粒體釋放到細胞質情況。結果顯示在WZ26(15μM)處理細胞24h后,細胞色素C從線粒體中釋放到細胞質中,紅色熒光從綠色熒光中擴散出來。WZ26(15μM)處理24h后Caspase9的活性也明顯增加。6、Western blottingting結果顯示WZ26作用于QBC-939細胞后時間和劑量依賴性抑制了STAT3的激活。7、劃痕實驗,Transwell,PCR和Western blottingting結果說明WZ26可以抑制TNF-α誘導的QBC-939細胞的遷移、浸潤和抑制TNF-α誘導的QBC-939細胞的上皮間質轉化。8、Western blottingting結果顯示WZ26還可抑制QBC-939細胞內TNF-α和LPS誘導的STAT3通路的激活。二、姜黃素類似物WZ26的體內抗腫瘤活性及機制研究研究結果發(fā)現(xiàn)WZ26通過升高腫瘤組織內活性氧水平,誘導線粒體損傷和細胞凋亡,明顯抑制小鼠QBC-939細胞皮下瘤生長。1、從體重和腫瘤數(shù)據可以看到,給藥組和對照組裸鼠的體重沒有明顯的差異,說明藥物對裸鼠基本無毒。從腫瘤體積圖中可以明顯看到,裸鼠給藥WZ26后,腫瘤體積減小,說明WZ26能夠抑制膽管癌QBC-939細胞生長。2、從Western blottingting結果可以看到,在腫瘤組織中促凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達增加,說明WZ26在體內也能夠促進膽管癌QBC-939細胞的凋亡。3、從免疫組化結果可以看到,與增殖相關的蛋白Ki67在給藥組表達減少,說明WZ26抑制了裸鼠體內膽管癌QBC-939細胞的增殖。結論:本文通過對WZ26的體內外抗膽管癌的作用及機制研究發(fā)現(xiàn),WZ26一方面通過升高膽管癌細胞中的氧化應激水平,從而激活線粒體凋亡通路來誘導細胞凋亡并阻滯細胞周期;另一方面通過抑制STAT3的磷酸化,抑制膽管癌細胞侵襲、遷移和上皮間質轉化(EMT)從而發(fā)揮抗膽管癌的作用。WZ26很有潛力成為膽管癌治療中的新一類候選藥物。同時,我們的研究也表明,靶向ROS水平和抑制炎癥因子的表達有可能成為治療膽管癌的重要策略。但是目前對該化合物作用靶點以及深入的抗膽管癌機制沒有十分明確,有待于進一步探討。
【圖文】：

3.1 WZ26 的結構和抑制膽管癌細胞的生存率通過對姜黃素的結構改造，去除其不穩(wěn)定基團，我們得到姜黃素單羰基類似物WZ26，其化學結構如圖 3-1A。以姜黃素為陽性對照，用 MTT 法檢測了 WZ26 對三種膽管癌細胞（RBE，QBC-939，HUCCA）生存率的影響。WZ26（濃度為 0.625，1.25，2.5，5，10，20μM）孵育膽管癌細胞 24 小時，實驗結果顯示 WZ26 可以劑量依賴性地降低膽管癌細胞的生存率，其中對測定的 RBE，QBC-939 和 HUCCA 細胞的 IC50 值分別為 4.7μM，4.8μM 和 4.2μM, 姜黃素對應 IC50 值分別為＞20μM，8.9μM和 10.8μM（圖 3-1-B-C）。這表明 WZ26 明顯抑制膽管癌細胞的生存率，作用效果要優(yōu)于姜黃素。同時，我們用 MTT 實驗對 WZ26 的毒性做了評估，WZ26 對正常膽管上皮細胞（HIBEC）的 IC50 值＞20μM（圖 3-1-B），這進一步表明 WZ26 可以選擇性的抑制膽管癌細胞的生存率，對正常細胞影響較小，安全性高。

WZ26誘導膽管癌細胞凋亡和周期阻滯A.WZ26（5，，10和15μM）分別處理膽管癌細胞RBE，QBC-939，HUCCA細胞24HUCCAQBC-939
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

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本文編號：2593646