發(fā)布時(shí)間：2020-03-22 14:07

【摘要】：目的:廣藿香屬于藥食同源,既是藿香正氣液(膠囊)、藿膽丸等40多種中成藥制劑的重要藥味,也是飲料、糖果、烘焙產(chǎn)品以及功能性食品中的常見植物成分,故其在市場(chǎng)上占有重要份額,極具開發(fā)潛力,提高和控制其藥材及揮發(fā)油的質(zhì)量顯得格外重要。廣藿香是傳統(tǒng)中醫(yī)防治消化系統(tǒng)疾病的芳香化濕要藥,其研究重點(diǎn)在于探討揮發(fā)性成分的胃腸調(diào)節(jié)作用。廣藿香醇、廣藿香酮和β-廣藿香烯是廣藿香中含量較高的芳香成分,現(xiàn)代研究已闡明廣藿香醇和廣藿香酮是廣藿香“芳香化濁,開胃止嘔”的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),具有抗胃潰瘍及潰瘍性結(jié)腸炎的作用,其中廣藿香醇更是我國(guó)國(guó)家和地方廣藿香藥材及其揮發(fā)油質(zhì)量分析鑒定的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)成分。但廣藿香藥材及其揮發(fā)油都是混合物,成分眾多,僅以廣藿香醇作為指標(biāo)成分控制藥材及揮發(fā)油的質(zhì)量明顯不足,故有必要引入其他廣藿香藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分形成指標(biāo)成分群,提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)格控制市場(chǎng)上藥材和揮發(fā)油的質(zhì)量。因此,探究廣藿香中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分十分必要。當(dāng)前廣藿香的胃腸保護(hù)活性研究集于廣藿香醇和廣藿香酮,而對(duì)β-廣藿香烯等其他含量較多成分缺乏研究。β-廣藿香烯與廣藿香醇結(jié)構(gòu)相似,研究發(fā)現(xiàn)廣藿香醇在酸性條件下會(huì)反應(yīng)生成β-廣藿香烯,而胃液正是酸性溶液,那么廣藿香醇在胃液中代謝是否會(huì)轉(zhuǎn)化為β-廣藿香烯,迄今尚未報(bào)道。若β-廣藿香烯是廣藿香醇在胃部的代謝物,是否跟廣藿香醇相似也具有防治胃潰瘍及潰瘍性結(jié)腸炎的活性,作用機(jī)制如何,迄今也未見相關(guān)報(bào)道。若β-廣藿香烯具有抗胃潰瘍及潰瘍性結(jié)腸炎的作用,而其又是廣藿香中含量較高的芳香性成分之一,無疑可作為廣藿香的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為廣藿香防治胃腸疾患提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí),β-廣藿香烯還可與廣藿香醇、廣藿香酮形成指標(biāo)成分群,用于提高和控制廣藿香藥材和揮發(fā)油的質(zhì)量,有利于廣藿香藥材市場(chǎng)的健康發(fā)展。因此,開展β-廣藿香烯的抗胃潰瘍及潰瘍性結(jié)腸炎的作用研究具有重要意義。本課題擬通過體內(nèi)外胃液代謝模型,考察廣藿香醇在胃液的代謝情況,探討廣藿香醇轉(zhuǎn)化為β-廣藿香烯的作用機(jī)理。其次,通過體外乙醇誘導(dǎo)的GES-1胃上皮細(xì)胞損傷模型,以及體內(nèi)無水乙醇和吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠急性胃潰瘍模型探討β-廣藿香烯抗胃潰瘍的作用及相關(guān)機(jī)理;同時(shí)通過體外LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型,以及體內(nèi)DSS誘導(dǎo)的小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型,探討β-廣藿香烯抗?jié)�瘍性結(jié)腸炎的作用及相關(guān)機(jī)理。方法:1.廣藿香醇的胃液代謝研究建立體內(nèi)外胃液代謝模型,用GC7890A-MSD5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀分析廣藿香醇的代謝物。采用HP-5MS 5%Phenyl Methyl Silox毛細(xì)管氣相色譜柱(30 m×250μm×0.25μm),設(shè)置250℃進(jìn)樣溫度,1.3 mL/min流速,60:1分流比。離子源采用EI,能量70eV,溫度230℃,四級(jí)桿溫度150℃,m/z范圍35~400,全掃描模式。采用以下程序升溫:50℃保持2 min,以60℃/min速率升溫至120℃,保持5 min,再以10℃/min速率升溫至150 ~oC,接著以60℃/min速率升溫至235℃,保持15 min。2.β-廣藿香烯抗胃潰瘍的作用研究體外研究采用乙醇誘導(dǎo)的GES-1胃上皮細(xì)胞損傷模型,通過MTT法檢測(cè)β-廣藿香烯干預(yù)后GES-1胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力,評(píng)價(jià)β-廣藿香烯對(duì)乙醇誘導(dǎo)的GES-1胃上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。體內(nèi)研究采用無水乙醇和吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠急性胃潰瘍模型,灌胃β-廣藿香烯,檢測(cè)胃液pH、胃黏膜潰瘍面積和抑制率,HE染色觀察組織形態(tài)且評(píng)分,評(píng)價(jià)β-廣藿香烯對(duì)無水乙醇和吲哚美辛致大鼠胃潰瘍的保護(hù)作用。通過測(cè)定SOD、GSH、CAT和MDA的含量,ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,免疫組化法測(cè)定Fas、FasL和caspase-3的蛋白表達(dá),qRT-PCR測(cè)定c-fos、c-jun和miR-21的基因表達(dá),Western blot檢測(cè)p65、IκB和ERK1/2的磷酸化水平,以闡述β-廣藿香烯對(duì)無水乙醇致大鼠胃潰瘍的保護(hù)機(jī)制。通過測(cè)定MPO的含量,ELISA法測(cè)定TNF-α、E-selectin、P-selectin、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、VEGF和ET-1的水平,免疫組化法測(cè)定COX-1和COX-2的蛋白表達(dá),qRT-PCR測(cè)定flt-1和ETAR的基因表達(dá),Western blot檢測(cè)IκBα和JNK的磷酸化水平及PGE_2的蛋白表達(dá),以闡述β-廣藿香烯對(duì)吲哚美辛致大鼠胃潰瘍的保護(hù)機(jī)制。3.β-廣藿香烯抗?jié)�瘍性結(jié)腸炎的作用研究體外研究采用LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型,β-廣藿香烯給藥后,Griess法檢測(cè)NO的含量,ELISA法檢測(cè)PGE_2、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10細(xì)胞因子的含量,qRT-PCR檢測(cè)COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的基因表達(dá),評(píng)價(jià)β-廣藿香烯對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用。體內(nèi)研究采用DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,灌胃β-廣藿香烯,記錄動(dòng)物體征,檢測(cè)胃液pH、結(jié)腸長(zhǎng)度和脾重,HE染色觀察腸組織形態(tài)且評(píng)分,評(píng)價(jià)β-廣藿香烯對(duì)DSS致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用。通過測(cè)定MPO的含量,ELISA法測(cè)定TNF-α、ICAM-1、P-selectin和LBP的水平,TUNEL法測(cè)定腸黏膜細(xì)胞凋亡情況,qRT-PCR測(cè)定occludin和ZO-1的基因表達(dá),Western blot檢測(cè)ROCK1、TLR4、MyD88的蛋白表達(dá),IκBα和MLC2的磷酸化水平,以及p65的核易位情況,以闡述β-廣藿香烯對(duì)DSS致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)機(jī)制。結(jié)果:1.廣藿香醇在胃液中的代謝研究體外研究中,廣藿香醇在鹽酸、人工胃液、大鼠離體胃液中均會(huì)代謝為β-廣藿香烯。然而廣藿香醇在人工胃液和大鼠離體胃液中的轉(zhuǎn)化率沒其在鹽酸中的高,推測(cè)廣藿香醇在胃液的代謝可能受胃蛋白酶、黏液、電解質(zhì)和內(nèi)在因子等因素的影響。體內(nèi)研究中,廣藿香醇在大鼠內(nèi)胃液中會(huì)代謝為β-廣藿香烯,但轉(zhuǎn)化率不高。pH測(cè)定發(fā)現(xiàn)體內(nèi)代謝研究中,大鼠胃液pH為1.5~5.5,而體外胃液代謝研究中大鼠離體胃液pH為1.5~2.0,兩者存在差異,推測(cè)胃液pH是影響廣藿香醇在胃液中代謝的重要因素。廣藿香醇在不同pH人工胃液中轉(zhuǎn)化率明顯不同,pH值越小,其轉(zhuǎn)化率越高。pH大于3.5時(shí),廣藿香醇基本不發(fā)生轉(zhuǎn)化。2.β-廣藿香烯抗胃潰瘍的作用研究體外乙醇誘導(dǎo)的GES-1胃上皮細(xì)胞損傷模型中,10、20和40μmol/L的β-廣藿香烯干預(yù)后均能增強(qiáng)GES-1細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù),提高細(xì)胞活力,相同劑量下藥效優(yōu)于廣藿香醇。體內(nèi)無水乙醇和吲哚美辛致大鼠急性胃潰瘍模型中,10、20和40 mg/kg的β-廣藿香烯灌胃給藥后均能減少潰瘍面積,改善胃組織形態(tài)且降低病理評(píng)分。相同劑量下,β-廣藿香烯比廣藿香醇更有效預(yù)防無水乙醇誘發(fā)的胃潰瘍,而不是吲哚美辛誘發(fā)的胃潰瘍。無水乙醇誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型中胃液pH為2.5左右,廣藿香醇給藥后在胃液并未發(fā)生明顯轉(zhuǎn)化;吲哚美辛誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型中胃液pH則為1.5左右,廣藿香醇給藥后可能在胃液中全部發(fā)生轉(zhuǎn)化。保護(hù)機(jī)制研究結(jié)果顯示,無水乙醇致大鼠胃潰瘍模型中,不同劑量β-廣藿香烯灌胃給藥后均能升高SOD、GSH和CAT的含量,以及降低MDA含量以抑制氧化應(yīng)激;能夠降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,以及下調(diào)p65與IκB蛋白的磷酸化水平以抑制NF-κB信號(hào)通路,減緩炎癥反應(yīng);能夠下調(diào)Fas、FasL和caspase-3的蛋白表達(dá),以及上調(diào)c-fos、c-jun和miR-21的基因表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平以抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡。吲哚美辛致大鼠胃潰瘍模型中,不同劑量β-廣藿香烯灌胃給藥后均能降低TNF-α、MCP-1、P-selectin、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1和MPO的水平,以及下調(diào)IκBα和JNK的磷酸化水平以抑制NF-κB與JNK信號(hào)通路,減緩炎癥反應(yīng);能夠升高COX-1、COX-2和PGE_2的蛋白表達(dá),促進(jìn)VEGF和flt-1表達(dá),以及抑制ET-1和ETAR表達(dá)以促進(jìn)血管生成,加速潰瘍愈合。3.β-廣藿香烯抗?jié)�瘍性結(jié)腸炎的作用研究體外LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中,10、20和40μmol/L的β-廣藿香烯干預(yù)后均能降低PGE_2、NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的水平和升高IL-10的水平,以及下調(diào)COX-2、iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達(dá)和上調(diào)IL-10的mRNA表達(dá),從而減緩炎癥反應(yīng)。體內(nèi)DSS致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中,5、10和20 mg/kg的β-廣藿香烯灌胃給藥后均能改善模型小鼠體重減輕、腹瀉、結(jié)腸縮短,以及組織缺損、炎性浸潤(rùn)、腺窩膿腫的情況,降低DAI指數(shù)。DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中胃液pH為2.0左右,廣藿香醇給藥后可能大部分在胃液中發(fā)生轉(zhuǎn)化,β-廣藿香烯與廣藿香醇在相同劑量下的藥效比較相差較大。保護(hù)機(jī)制研究結(jié)果顯示,DSS致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中,不同劑量β-廣藿香烯灌胃給藥后均能減少腸黏膜細(xì)胞的凋亡,降低組織和血清中LBP的含量,上調(diào)occludin和ZO-1的mRNA表達(dá),下調(diào)ROCK1蛋白的表達(dá)以及MLC2的磷酸化水平,以抑制ROCK-MLC信號(hào)通路,保護(hù)腸黏膜屏障功能;同時(shí)能夠降低TNF-α、ICAM-1、P-selectin和MPO的水平,下調(diào)TLR4和MyD88的蛋白表達(dá),抑制IκBα的磷酸化以及p65亞基的核易位,從而抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路,調(diào)節(jié)免疫功能以減緩腸黏膜的損傷。結(jié)論:通過體內(nèi)外胃液代謝實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)廣藿香醇在胃液中會(huì)代謝為β-廣藿香烯,其轉(zhuǎn)化率可能與胃液pH、胃蛋白酶、黏液、電解質(zhì)和內(nèi)在因子等因素相關(guān),其中胃液pH尤其重要。通過抗胃潰瘍活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)β-廣藿香烯可對(duì)抗無水乙醇引起的胃潰瘍,且藥效優(yōu)于廣藿香醇,作用機(jī)制與其抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用相關(guān);同時(shí),發(fā)現(xiàn)β-廣藿香烯可對(duì)抗吲哚美辛引起的胃潰瘍,藥效與廣藿香醇相似,作用機(jī)制與其抗炎和促血管再生的作用相關(guān)。通過抗?jié)�瘍性結(jié)腸炎活性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)β-廣藿香烯可對(duì)抗DSS引起的潰瘍性結(jié)腸炎,且藥效強(qiáng)于廣藿香醇,作用機(jī)制與其調(diào)節(jié)免疫功能、保護(hù)腸黏膜屏障功能的作用相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示β-廣藿香烯具有抗胃潰瘍及潰瘍性結(jié)腸炎的作用,是廣藿香治療消化系統(tǒng)疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一,可為今后提升廣藿香藥材及揮發(fā)油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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