發(fā)布時間：2020-03-22 14:42

【摘要】：宮頸癌主要是由人乳頭瘤病毒持續(xù)感染引起的癌癥,主要包括宮頸鱗狀細胞癌和宮頸腺癌。雖然早、中期患者通過手術治療多數(shù)預后良好,但晚期和復發(fā)患者的治療效果仍有限,因此急需開發(fā)新型治療方法和藥物。近年的研究發(fā)現(xiàn),細胞在惡性轉(zhuǎn)化過程中,產(chǎn)生了許多生化通路的改變,這些癌細胞高度依賴、而正常細胞依賴程度低的生化特征可能是癌細胞的脆弱點,因此可用于對其進行選擇性攻擊。臨床實踐及實驗研究都證明,癌細胞比正常細胞對ROS更敏感,進一步升高癌細胞的ROS或削弱其抗氧化能力被認為是有效的抗癌方式。淫羊藿是藥用價值極高的傳統(tǒng)中藥,其主要活性成分是淫羊藿苷(Icariin)和淫羊藿素(Icaritin)等。大量研究證明淫羊藿素能誘導多種癌細胞發(fā)生凋亡,其機理被認為與JAK/STAT、MAPK或PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制有關。但以上信號通路的抑制與癌細胞凋亡同時發(fā)生,其原因-后果關系有待確定。一些研究觀察到淫羊藿素處理的癌細胞中ROS水平顯著升高并伴隨細胞凋亡,但ROS與細胞凋亡之間的因果關系或ROS如何激活凋亡等尚不清楚。為此,本研究對淫羊藿素抑制宮頸腺癌細胞株HeLa和鱗狀上皮細胞癌細胞株SiHa的效果以及ROS在其抗癌活性中的作用進行了探討。首先,MTT實驗顯示淫羊藿素處理48小時后,HeLa和SiHa兩種癌細胞的生長均受到顯著抑制(IC_(50)分別為12.5和17μM),而非惡性的CCD?1095Sk成纖維細胞和HEK293人胚腎上皮細胞則只受到輕微影響,說明淫羊藿素對癌細胞有選擇性毒性。其次,淫羊藿素處理HeLa和SiHa細胞3小時后,細胞內(nèi)ROS水平即已顯著升高,而用N-乙酰半胱氨酸(NAC)阻斷ROS升高后,淫羊藿素的抑制作用即基本消失,說明淫羊藿素引起的ROS升高是其對HeLa和SiHa細胞選擇性毒性的基礎。接下來的堿性彗星電泳實驗表明淫羊藿素處理12小時后,HeLa和SiHa細胞內(nèi)DNA斷裂數(shù)量顯著上升,加入OGG1 DNA糖苷酶后DNA斷裂數(shù)進一步升高,而NAC處理阻止了淫羊藿素所致DNA斷裂的上升,說明淫羊藿素處理所致ROS升高引起了顯著的DNA氧化損傷,由此導致了大量DNA鏈斷裂。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)淫羊藿素處理6小時后γH2AX和53BP1陽性細胞數(shù)均顯著增多,用NAC處理后顯著減少,進一步證明淫羊藿素處理引起了大量DNA損傷并激發(fā)了DNA損傷反應(DDR)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)CDC25C-pS216隨淫羊藿素處理濃度的加大而升高,而CDK1-pT14水平下降。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿素處理HeLa和SiHa細胞24小時后,發(fā)生了G_2/M期細胞周期阻滯,NAC處理阻斷了CDC25C和CDK1蛋白的變化以及G_2/M期周期阻滯,顯示DNA損傷反應激活了G_2/M細胞周期檢驗點且與淫羊藿素所致ROS有關。Western blot檢測同時顯示活化的caspase 3和caspase 9以及Bax蛋白隨淫羊藿素處理濃度的加大而升高,而Bcl-2和XIAP蛋白下降;流式細胞術和線粒體膜電位檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿素處理HeLa和SiHa細胞后,凋亡細胞比例呈時間依賴性增加,而NAC處理降低了凋亡蛋白的變化以及凋亡細胞數(shù)的上升,顯示ROS所致DNA損傷反應同時激活了細胞凋亡。此外,qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明淫羊藿素處理前后HPV E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均無明顯改變,提示淫羊藿素對HeLa和SiHa的細胞毒性與HPV病毒基因的表達無關。為了系統(tǒng)地分析淫羊藿素對宮頸癌細胞的作用機理,藥物刺激前后HeLa細胞蛋白質(zhì)組學的變化以同位素二甲基標記和串聯(lián)質(zhì)譜技術進行測定。通過對蛋白質(zhì)提取,分離及質(zhì)譜鑒定,共同定量到716種蛋白質(zhì),藥物刺激后,14種蛋白質(zhì)顯著上調(diào),62種蛋白質(zhì)顯著下調(diào)。利用生物信息學方法對差異蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)整理與分析。發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白主要涉及12種分子功能;參與細胞過程調(diào)節(jié)及刺激應答相關蛋白質(zhì)數(shù)目較多;差異表達蛋白多集中于細胞質(zhì)、細胞核和外泌體;參與癌癥通路等,檢測到細胞凋亡相關蛋白基因數(shù)6個。印證了淫羊藿素最終誘發(fā)宮頸癌細胞內(nèi)源凋亡途徑。為支持淫羊藿素的開發(fā),以計算機輔助的虛擬篩選技術對淫羊藿素的成藥性和毒理學性質(zhì)進行了分析。結(jié)果預測淫羊藿素具有很好的水溶性和腸道吸收性;其血漿蛋白結(jié)合率小于90%,具有很高的血腦屏障通透性;毒理學性質(zhì)分析預測淫羊藿素的致突變性和致癌性低,且有良好的ADMET性質(zhì)。通過本研究,進一步揭示了淫羊藿素的抗癌機理,預測了其具有良好的成藥性,為淫羊藿素開發(fā)提供了重要數(shù)據(jù)和參考信息。
【圖文】：

圖 1.2.1 淫羊藿苷分子（A）和淫羊藿素分子式（B）2 淫羊藿素的抗腫瘤作用淫羊藿素對不同類型腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，淫羊藿素可以抑制增殖、誘導調(diào)亡，調(diào)控細胞周期、抗血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和免疫調(diào)節(jié)多種細胞靶點以及信號通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。目前已經(jīng)證實，淫羊藿素癌[93]、白血病[94]、惡性淋巴瘤[95]、前列腺癌[96]、宮頸癌[97]以及肝細胞癌具有抑制增殖和促凋亡作用。如對乳腺癌，2-5μM 的淫羊藿素可發(fā)揮抗雌體作用，抑制乳腺癌細胞的增殖，使細胞周期阻滯在 G2/M 期甚至誘發(fā)凋生；對于白血病、惡性淋巴瘤以及多發(fā)性骨髓瘤等，淫羊藿素表現(xiàn)出劑誘導細胞凋亡，引起周期阻滯于 G2/M 期，且副作用很低[99]；對于前列腺藿素有利于促進雄激素受體（Androgen Receptor，， AR）以及雄激素受體

圖 1.3.2 ROS 來源途徑OS 的清除機制會為細胞帶來極大的損害，而細胞也進化出了一述，對于 O2ˉ的清除，主要依賴于 SOD 迅速轉(zhuǎn)化為主要依賴于抗氧化蛋白（peroxiredoxins，PRXs）thione peroxidase，GPXs）以及過氧化氫酶（catal H2O[116，117]。這幾種酶會在氧化態(tài)與還原態(tài)之間實現(xiàn)氧化壓力，進行氧化還原反應平衡調(diào)節(jié)的主要調(diào)我保護機制。當進行蛋白酶體亞基調(diào)節(jié)，異生物質(zhì)，NRF2 作為一種轉(zhuǎn)錄因子被激活，使下游大量蛋2 的存在時間很短，通過與胞漿中的 KEAP1 以及1 相互作用介導蛋白酶體降解過程[119]。當 H2O2的
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2595188