發(fā)布時(shí)間：2020-07-06 13:28

【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?肝癌是全世界范圍內(nèi)與癌癥相關(guān)的最常見(jiàn)的死亡原因之一。肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率較高,患者的預(yù)后較差,而中國(guó)是肝癌高發(fā)區(qū)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肝癌轉(zhuǎn)移中扮演關(guān)鍵角色,與肝癌侵襲、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及低存活率密切相關(guān)。因此,抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT具有重要意義。華蟾毒它靈(Cinobufotalin)是中藥蟾酥的主要成分之一,具有廣譜的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)的目的是探討cinobufotalin能否抑制肝癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移,并初步探討其分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)cinobufotalin對(duì)肝癌Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響;用倒置顯微鏡觀察cinobufotalin對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cinobufotalin對(duì)兩種肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin、Slug、ZEB1)和遷移相關(guān)蛋白(β-catenin、DKK1、MMP7)表達(dá)的影響;wound healing實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)cinobufotalin對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響;用熒光定量PCR法和western blotting法檢測(cè)cinobufotalin對(duì)肝癌細(xì)胞中β-catenin基因表達(dá)和其細(xì)胞漿與細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達(dá)量的影響;采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法,構(gòu)建β-catenin過(guò)表達(dá)和β-catenin敲減的Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞模型�；�于上述細(xì)胞模型,檢測(cè)β-catenin在cinobufotalin調(diào)控Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞EMT中的作用;建立BALB/c小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤模型,在動(dòng)物水平評(píng)價(jià)cinobufotalin對(duì)腫瘤細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移的影響;通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)小鼠肺腫瘤灶中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,cinobufotalin抑制Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖并呈時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。2、用cinobufotalin處理肝癌細(xì)胞24 h后,可以發(fā)現(xiàn)在給藥前后,細(xì)胞形態(tài)從紡錘形的間充質(zhì)樣形狀轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形的上皮樣形狀。3、Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在肝癌細(xì)胞中cinobufotalin能顯著影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá),即上調(diào)上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá),抑制間充質(zhì)標(biāo)志蛋白Vimentin、ZEB1、Slug、Snail和N-cadherin的表達(dá)。4、Wound healing、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,cinobufotalin能顯著抑制肝癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,cinobufotalin顯著降低β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá),并抑制β-catenin核蛋白的表達(dá)。6、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了β-catenin過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞株模型。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,β-catenin過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞株的EMT活性,而cinobufotalin能逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)β-catenin對(duì)EMT相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。Wound healing、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,cinobufotalin明顯逆轉(zhuǎn)了過(guò)表達(dá)β-catenin對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的誘導(dǎo)作用。7、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了β-catenin低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株模型。本部分實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞中,β-catenin低表達(dá)顯著抑制細(xì)胞株的EMT活性及遷移與侵襲能力,且cinobufotalin使該抑制作用增強(qiáng)。8、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,cinobufotalin顯著抑制BALB/c小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶的形成和轉(zhuǎn)移。9、免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在動(dòng)物水平,cinobufotalin抑制腫瘤發(fā)生EMT。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:Cinobufotalin通過(guò)下調(diào)β-catenin的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

圖 1-1：EMT 的三種亞型[23]原發(fā)腫瘤中分離出癌細(xì)胞，然后使癌細(xì)胞侵入鄰近組織并胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[25,26]。據(jù)報(bào)道，約 90%的癌癥死亡有越來(lái)越多的證據(jù)表明，EMT 與癌細(xì)胞的侵襲、遷移和自要聯(lián)系[29]。臟中，肝細(xì)胞間彼此粘附且極化并呈現(xiàn)出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞，健康的肝細(xì)胞是缺乏基底膜的。因此，健康、成熟的位于竇周間隙（Disse 間隙）的肝星狀細(xì)胞分離。當(dāng)發(fā)生肝強(qiáng)，并且由于將肝細(xì)胞從肝血竇分離的膜屏障的缺乏使肝腫Chen 等人[31]的研究闡述了惡性肝細(xì)胞變得更加具有遷移性L 的擴(kuò)增可以導(dǎo)致 ARHGEF9 的激活和小 GTP 結(jié)合蛋白 C使腫瘤肝細(xì)胞穿過(guò) Disse 間隙，侵入鄰近的血管并隨血液循外（圖 1-2）。Lee TK[32]和 Battaglia S[33]分別提出，培養(yǎng)肝

圖 1-2：肝癌和 EMT[30]1.2.2 β-catenin 在 EMT 過(guò)程中扮演重要角色β-catenin 蛋白由位于染色體 3p21~22 的 CTNNb1 基因編碼，C 端由負(fù)責(zé)靶基因轉(zhuǎn)激活的氨基酸殘基構(gòu)成，N 端由富含 Thr/Ser 位點(diǎn)的氨基酸殘基組成。當(dāng)胞質(zhì)中β-catenin 蓄積到一定量后，β-catenin 進(jìn)入細(xì)胞核并與 TCF/LEF-1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)物，啟動(dòng)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因如 c-Myc、MMP7 等[35,36]，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)EMT。當(dāng)胞質(zhì)中聚集的 β-catenin 入核后 E-cadherin 游離分散，從細(xì)胞連接處重新分到其他的區(qū)域，從而降低了細(xì)胞間粘附能力，并伴隨著下調(diào)上皮標(biāo)志物 E-cadherin 的達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物 Vimentin 的表達(dá)，進(jìn)而促使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)了細(xì)胞的 EMT 進(jìn)程，增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲的可能性[37-40]。β-catenin 也是 Wnt 信號(hào)通中的關(guān)鍵因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用[41,42]。β-catenin 與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[43,44]，在腸上皮組織及其他組織中，β-cateni

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本文編號(hào)：2743696