發(fā)布時間：2020-11-10 08:09

　　 干旱是影響全球作物生長和生產(chǎn)力的主要環(huán)境壓力之一,而全球變暖和水資源短缺加速了環(huán)境惡化程度。因此,當(dāng)前迫切需要增強(qiáng)農(nóng)作物抗逆性,提高其抗旱能力。植物內(nèi)生菌可以幫助植物應(yīng)對來自外界的逆境脅迫,增強(qiáng)抗壓能力,而植物與微生物互作的先決條件是內(nèi)生菌能夠有效地定殖在植物體內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)了一株具有多種促植物生長功能的內(nèi)生細(xì)菌駱駝刺泛菌Pantoea alhagi LTYR-11Z。該菌株可以有效定殖在小麥根部組織并提高宿主的抗旱能力。前期通過構(gòu)建該菌株的轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫,篩選到一個與定殖相關(guān)的全局調(diào)控基因cra。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析(RNA-seq),發(fā)現(xiàn)cra敲除突變株中284個基因的轉(zhuǎn)錄水平與野生型相比具有顯著差異,其中180個基因受到Cra蛋白的正向調(diào)控,104個受其負(fù)調(diào)控。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)深入挖掘,發(fā)現(xiàn)eps操縱子(B1H58_14485-B1H58_14530)在?cra中的表達(dá)量中顯著下調(diào)。通過實(shí)時定量PCR(Real Time PCR)、β-半乳糖苷酶酶活檢測以及凝膠阻滯遷移(EMSA),本研究確定了Cra直接正向調(diào)控eps操縱子的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而預(yù)測并通過點(diǎn)突探針驗(yàn)證了Cra與eps操縱子啟動子的結(jié)合位點(diǎn)。本研究還檢測了野生型P.alhagi LTYR-11Z,?cra突變體與互補(bǔ)菌株中胞外多糖(EPS)的產(chǎn)量,證實(shí)了Cra對胞外多糖生物合成的正調(diào)控作用。隨后采用結(jié)晶紫染色法檢測了野生型,?cra,?tuaG突變株生物膜生成量,發(fā)現(xiàn)Cra通過促進(jìn)eps操縱子的表達(dá)而促進(jìn)其生物膜的生成。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中anti-FlhD_4C_2因子同源基因ydiV(B1H58_18220)在?cra中的表達(dá)下調(diào)超過2.2倍,表明Cra可能調(diào)控鞭毛的生物合成。本研究通過泳動實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)突變cra基因后菌株運(yùn)動能力增強(qiáng),與單一敲除cra基因相比,敲除cra、ydiV基因后菌株運(yùn)動能力進(jìn)一步提升,并且在雙突菌株中回補(bǔ)cra未能使運(yùn)動能力恢復(fù)至野生型水平,說明Cra通過調(diào)節(jié)ydiV基因的表達(dá)抑制P.alhagi LTYR-11Z的運(yùn)動能力。為證明YdiV作為anti-FlhD_4C_2因子的活性,采用EMSA檢測了His6-YdiV對His6-FlhD_4C_2和fliA啟動子之間相互作用的影響,結(jié)果表明在P.alhagi LTYR-11Z中ydiV編碼抑制FlhD_4C_2與fliA啟動子結(jié)合的anti-FlhD_4C_2因子;采用同樣的方法確定了Cra直接正向調(diào)控ydiV基因的表達(dá),并預(yù)測和驗(yàn)證了Cra與ydiV啟動子的結(jié)合位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)編碼負(fù)責(zé)c-di-GMP合成的雙鳥苷酸環(huán)化酶的yedQ的轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)。本研究采用體外酶活實(shí)驗(yàn)檢測P.alhagi LTYR-11Z中YedQ蛋白具有雙鳥苷酸環(huán)化酶活性,同時確定Cra直接正調(diào)控yedQ基因的表達(dá)。通過檢測胞內(nèi)c-di-GMP含量發(fā)現(xiàn)缺失cra基因的突變體胞內(nèi)c-di-GMP水平降低至正常水平的48%,說明Cra可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)c-di-GMP的水平。表型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與野生型P.alhagi LTYR-11Z相比,?yed Q的運(yùn)動能力增強(qiáng);EPS產(chǎn)量降低;生物膜形成能力減弱。綜合以上結(jié)果,可以得出以下結(jié)論:Cra直接與eps操縱子、ydiV、yedQ基因啟動子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)胞外多糖的產(chǎn)生和anti-FlhD_4C_2因子的合成,并提高胞內(nèi)c-di-GMP水平,導(dǎo)致細(xì)菌的生物膜形成能力增強(qiáng),而運(yùn)動能力下降,從而增強(qiáng)其定殖能力。隨后,本研究通過改變培養(yǎng)基中的碳源,發(fā)現(xiàn)與糖裂解環(huán)境相比,在糖異生環(huán)境中Cra的對eps操縱子、ydiV、yedQ基因轉(zhuǎn)錄激活作用更加明顯。在EMSA實(shí)驗(yàn)中添加FBP降低了相應(yīng)Cra-DNA復(fù)合物的形成,證明P.alhagi LTYR-11Z中Cra與eps,ydiV和yedQ的啟動子的結(jié)合可以被糖酵解代謝物FBP抑制。編碼6-磷酸果糖激酶的pfkA基因突變導(dǎo)致F6P瞬時積累,但代謝中間體如FBP的濃度下降,本研究敲除pfkA基因后,eps,ydiV和yedQ的啟動子活性與野生株相比顯著增強(qiáng),也證明了這一觀點(diǎn)。此外,植物根系分泌物在植物-微生物互作過程中起著重要的作用,并可能調(diào)控植物促生菌中定殖相關(guān)基因的表達(dá),本研究發(fā)現(xiàn)水培14天的小麥根際分泌物可以增強(qiáng)Cra對其靶基因表達(dá)的激活作用。綜上所述,本研究在P.alhagi LTYR-11Z中確定了Cra響應(yīng)不同碳源調(diào)節(jié)胞外多糖合成,鞭毛生物合成和c-di-GMP的合成,進(jìn)而調(diào)控其定殖行為的作用機(jī)制,并建立了一個模型來解釋細(xì)菌中碳代謝調(diào)節(jié)因子Cra介導(dǎo)的定殖調(diào)控機(jī)制。本研究提出了植物內(nèi)生菌響應(yīng)環(huán)境中不同碳源調(diào)節(jié)其定殖行為的新策略,取得的研究成果對于今后進(jìn)一步深入研究細(xì)菌的碳源依賴性定殖行為奠定基礎(chǔ),具有重要的理論價值和潛在應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S512.1;S182
【部分圖文】：

有 22 個 CsrA 結(jié)合位點(diǎn)，而 CsrC 含有 9 個。csrB 和 csrC 的表達(dá)由受 CsrA 調(diào)控的 BarA-UvrY 雙分子開關(guān)激活。CsrD 蛋白促進(jìn) CsrB 和 CsrC 的 RNaseE 依賴性從而調(diào)控 CsrB和 CsrC 的水平，通過刺激 BarA 的產(chǎn)生，導(dǎo)致其拮抗劑的水平增加。CsrA 通過更大的反饋途徑自動調(diào)節(jié)其活性。另一個碳代謝調(diào)節(jié)因子 Cra 則可抑制參與糖酵解的基因的表達(dá)，同時激活葡糖異生基因的表達(dá)（Saier Jr and Ramseier, 1996）。 因此，Cra 對碳代謝的影響與 CsrA 相反。Cra 作為轉(zhuǎn)錄因子，與被調(diào)節(jié)基因啟動子區(qū)域中的回文序列結(jié)合，通過與 RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)相對位置的不同來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。如果 Cra 結(jié)合于 RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的上游，則 Cra 促進(jìn)下游操縱子的轉(zhuǎn)錄；如果 Cra 結(jié)合位點(diǎn)與 RNA 聚合酶結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域重疊或位于其下游，則 Cra 抑制該操縱子的轉(zhuǎn)錄（Saier Jr and Ramseier, 1996）。CsrA 和 Cra 調(diào)節(jié)的主要調(diào)控物質(zhì)是磷酸果糖激酶（Pfk）。Pfk 可以磷酸化果糖-1-磷酸為果糖-1,6-二磷酸，這一反應(yīng)在生理?xiàng)l件下是不可逆的（圖 1-1B）。在大腸桿菌中，由 pfkA 基因編碼的主要酶 PfkI 占總細(xì)胞磷酸果糖激酶活性的 90％（HELLINGA andEVANS, 1985）。CsrA 和 Cra 通過調(diào)節(jié) PfkI 和第二種酶 Pps 將丙酮酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸來控制糖酵解和糖異生途徑（圖 1B）（Park et al., 1987）。

第一章 文獻(xiàn)綜述 15的內(nèi)生細(xì)菌，具有重要的理論研究價值和潛在應(yīng)用前景。在研究 Pantoea alhagi LTYR-11Z 的過程中，實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Cra 參與該菌的碳代謝調(diào)節(jié)和對小麥的定殖與共生抗旱。為進(jìn)一步挖掘該菌促小麥抗旱的潛能，本研究選擇碳代謝與定殖調(diào)控因子 cra進(jìn)行深入研究，期待揭示其在菌株中的調(diào)控模式，為內(nèi)生菌促作物抗旱機(jī)理研究方面提供研究思路，并為今后利用西北旱區(qū)特色內(nèi)生菌資源增強(qiáng)作物抗旱性的農(nóng)業(yè)實(shí)踐提供重要參考。1.6 技術(shù)路線前期實(shí)驗(yàn)室已通過 Tn5 插入突變篩選到影響 Pantoea alhagi LTYR-11Z 中根定殖能力的基因 cra，對此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計了包括基因敲除等一系列研究方案以期完成所需研究的目的。主要研究技術(shù)路線如下：

圖 2-1 PCR 篩選突變菌株 ΔcraYR-11Z DNA 為模板設(shè)計陰性對照。+：以 pTargetF-Δcra 為Fig 2-1 PCR verification of mutant Δcrai LTYR-11Z DNAas negative control, +: pTargetF-Δcra as pos Ni-NTA 純化柱純化出的 Cra 蛋白。圖 2-2 SDS-PAGE 分析純化的 Cra 蛋白o(hù)mbinant proteins analysis by 15% SDS-PAGE. M: protein ma
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Luisa F.Castiblanco;George W.Sundin;;New insights on molecular regulation of biofilm formation in plant-associated bacteria[J];Journal of Integrative Plant Biology;2016年04期

本文編號：2877700