發(fā)布時間：2020-11-22 10:08

　　 進一步完善滇重樓人工栽培技術是其產業(yè)化發(fā)展的必由之路。除了優(yōu)化種質資源、科學的田間管理之外,深入挖掘內生微生物資源也勢必對滇重樓的可持續(xù)利用大有裨益。本論文針對滇重樓根莖內生細菌的多樣性這一基本科學問題,通過選擇性分離培養(yǎng)技術和高通量測序技術兩種方法策略,對滇重樓內生細菌資源進行全面的分析和挖掘。同時多樣性研究發(fā)現根瘤菌是優(yōu)勢類群之一,且通過分離培養(yǎng)得到一批相關菌株,因此論文圍繞根瘤菌開展了深入的系統(tǒng)發(fā)育基因組學的研究。首先通過高通量測序技術,對云南省4個地區(qū)的滇重樓根莖內生及根際土壤環(huán)境細菌進行了生物多樣性及群落功能的比較分析。兩者中均蘊藏豐富的細菌類群,主要分布于放線菌門、厚壁菌門和變形桿菌門,但根際土壤的細菌類群多樣性更高。細菌群落結構兩者存在差異,在目級分類水平上,優(yōu)勢類群有異同、且有的類群在相對豐度上差異顯著。通過對群落功能的預測和比較發(fā)現,根際土壤與根莖內生環(huán)境的群落功能也存在顯著差異。此外,在對不同樣點進行分析后發(fā)現,中甸樣點根莖內生樣本的細菌多樣性較其他樣點不同,但群落功能無明顯差異,表明中甸樣點根莖內生樣本中的主要優(yōu)勢功能類群與其它樣本一致。在隨后的純培養(yǎng)研究中,通過7種分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng),共獲得并鑒定云南6個地區(qū)滇重樓根莖內生細菌289株。相比免培養(yǎng)研究中檢測到的優(yōu)勢細菌類群分布于3個門,18個目,83個屬,純培養(yǎng)分離到的菌株分布于同樣的3個門,并分屬于5個綱、14個目、25個科、42個屬,其中包括22個潛在的新分類單元；在每個樣點中都分離到不同于其它樣點的屬一級類群。此外,35株菌的發(fā)酵產物中檢測到甾體皂苷類化合物；25株菌可在無氮源培養(yǎng)基上生長。對4個潛在新分類單元的菌株進行多相分類研究,確定了它們的分類地位。菌株py1111~T、Py1134~T為Rhizobium屬的新種,分別命名為Rhizobium radicis sp. nov及Rhizobium gengmaense sp. nov.; py1294~T為Oceanobacillus屬的1個新種,命名為Oceanobacillus endoradicis sp. nov.; py 1292~T為Yimella屬的1個新種,命名為Yimellaradicis sp. nov.。通過測定41株Rhizobium屬典型種基因組序列和系統(tǒng)發(fā)育基因組學研究,發(fā)現Rhizobium屬及其近緣類群形成4個主要的進化分枝,多數具有共生固氮功能的典型Rhizobium屬物種處于較晚的進化分枝上。對共生固氮相關蛋白的深入比較分析發(fā)現,共生質粒同源蛋白在Rhizobium屬及其近緣類群中起源較早,基因缺失是造成一些物種丟失固氮作用的主要原因。共生固氮作用中的關鍵蛋白NifH、FixC和NodC在該類群中的平均相似性差異表明,它們在進化過程中受到不同的選擇壓力,或者個別基因存在橫向基因轉移的可能。從基因組層面深入分析了相關類群各物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系,闡明了共生固氮在Rhizobium屬及其近緣類群中演化的主要機制。本論文的研究結果有助于理解根際土壤微生物菌群與滇重樓內生菌群之間的關系、全面認知滇重樓根莖內生細菌的物種多樣性,并為積累與滇重樓有關的內生菌資源打下基礎,更為人工栽培技術的優(yōu)化提供理論指導。同時通過分離純培養(yǎng)獲得一批與滇重樓相關的內生細菌資源,為后期菌種資源開發(fā)提供寶貴的材料。圍繞根瘤菌屬及其近緣類群的系統(tǒng)發(fā)育基因組學理論研究,首次嘗試從組學層面解決相關類群的系統(tǒng)分類學問題,并在該類群中共生固氮作用起源進化研究方面取得重要進展。與植物宿主相關微生物群落、菌種資源是微生物功能開發(fā)、群落生態(tài)、系統(tǒng)進化等研究的重要材料,相信隨著高通量測序和純培養(yǎng)技術的突破,植物內生微生物學研究將取得不斷發(fā)展,并推動微生物資源的開發(fā)與利用。
【學位單位】：云南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2016
【中圖分類】：S567.239;S182
【部分圖文】：

云南大學博±學位論文??２．２．２實時巧光定量ＰＣＲ結果??通過實時巧光定量ＰＣＲ對來源于耿馬、楚雄、中甸、彌勒及個舊這５個樣點??的根莖內生及根際主壤樣品中的細菌１６ＳｒＲＮＡ基因及真菌ＩＴＳ基因進行了絕對定??量，定量結果如表２．１所示。５個不同樣點的濱重樓根際主壤樣品中，細菌與真菌??的數量大致相當，耿馬、中甸、個舊的樣品中真菌略占多數（分別為６４．２％，５９．７％，??６７．１％），楚雄和彌勒的樣品中細菌略占多數（５６．５％，５４．１％）。與此不同的是，濱??重樓根莖內生菌在不同的樣點中均細菌為主，占比達到９９．９％，只有Ｐ００２為??９５．６％；而真菌僅占極少量煙２．３）。該結果表明在演重樓根莖內生環(huán)境中，細菌??比真菌多；而根際止壤中兩者數量基本相當。這也從一方面表明對演重樓根莖內??生樣品進行細菌多樣性研究的重要。??＾＂

第二章潰重樓根莖內生及根際王巧環(huán)境細免培養(yǎng)多樣性研巧??維度上距離稍遠，物種組成有不同。只有來自楚雄的其中一個樣品作００７）與其他??植物內生樣品偏離較明顯，在圖中位置居于根際±壌和其他植物內生樣品之間，??考慮是否在樣品處理過程中，表面消毒不徹底所致。同時，４個樣點的根際±壤樣??品聚在ＰＣｏＡ圖右側，尤其是中甸、彌勒、耿馬的樣品在圖上坐標軸的距離較近，??表明它們的物種組成類似，而楚雄樣品的位置稍遠，這個結果與上節(jié)中通過Ａｌｐｈａ??多樣性分析所揭示的結果一致。??

在Ｗ?ｗｅｉｇｈｔｅｄ構建的聚類樹上與同來源于楚雄根際的樣品Ｐ０２５聚在一枝，與ＰＣｏＡ??圖得到的結果類似；而在ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ計算方法構建的聚類樹上Ｐ００７與根莖內生樣??品聚在一起。４個樣點的植物內生樣品在聚類圖上交雜在一起，并沒有表現出明雖??的樣點間的差異。??２．２．３．５織巧群落功能巧諷??樣品中ＯＴ化序列信息在ＫＥＧＧ數據庫中影射的結果（圖２．１０）顯示，耿馬漠??重樓根莖內生樣品ＯＴＵｓ能夠映射到的基因組功能信息比例最高，超過９０％；其??次分別為楚雄、中甸的內生樣品，而彌勒２個樣品的差異較大。前面的分析中，??己注意到楚雄的Ｐ００７樣品與其他內生樣品的群落多樣性不同，而其在ＫＥＧＧ的未??匹配比例也較楚雄樣點的其他２個樣品離。根際±壤環(huán)境樣品的未匹配比例均較??內生環(huán)境高，尤其是彌勒、中甸、耿馬的樣品有超過４０％的ＯＴＵｓ片段未在ＫＥＧＧ??數據庫中影射到相關結果，說明±壌樣品中存在大量未知的類群。??夏
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相關期刊論文 前10條

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本文編號：2894535