發(fā)布時間：2020-11-13 01:43

　　 Cry毒素作為蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)產(chǎn)生的一類重要?dú)⑾x蛋白已被廣泛應(yīng)用于鱗翅目和鞘翅目等農(nóng)業(yè)害蟲的防治。隨著含cry基因的抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的大量種植,諸如飛虱、葉蟬、蚜蟲、椿象等半翅目非Bt靶標(biāo)昆蟲很有可能發(fā)展成為主要害蟲。雖然對此類害蟲有毒性作用的Bt毒素已有報道,但已商品化使用的Cry1，Cry2等Bt毒素對此類害蟲無毒或低毒的原因尚不明朗。膜穿孔機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是目前關(guān)于Cry毒素的兩種主要?dú)⑾x作用機(jī)制模型。在兩種潛在模型中,靶標(biāo)昆蟲中腸內(nèi)特定膜蛋白,如鈣粘蛋白(Cadherin)、氨肽酶N(aminopeptidaseN，APN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)因子(ABC transpoter C2，ABCC2)等與Cry毒素domain Ⅱ中暴露在毒素空間結(jié)構(gòu)表面的3個環(huán)區(qū)(loop)相結(jié)合是其毒性作用發(fā)揮的關(guān)鍵。為此,本研究以半翅目水稻害蟲褐飛虱(Nilaparvatalugens，brownplanthopper，BPH)為研究對象,分析褐飛虱中腸上皮細(xì)胞膜上可能與Cry毒素結(jié)合的蛋白,并對預(yù)測的蛋白進(jìn)行序列及功能驗(yàn)證。首先通過第二代高通量測序技術(shù)對褐飛虱若蟲中腸及全蟲mRNA分別進(jìn)行測序,構(gòu)建褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)褐飛虱中腸內(nèi)存在大量具有高豐度轉(zhuǎn)錄水平并與已知Cry毒素受體同源的膜結(jié)合蛋白,包括膜結(jié)合APN、ALP及Cadherin等。利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)對褐飛虱中腸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的apn、及cadherin基因序列進(jìn)行驗(yàn)證后,對這些Cry毒素受體同源蛋白的功能域、三維空間結(jié)構(gòu)、表達(dá)量以及糖基錨定(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)功能位點(diǎn)等特征進(jìn)行了預(yù)測、分析,利用同源比對分析手段對上述蛋白與Cry毒素靶標(biāo)昆蟲中腸內(nèi)已知結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行序列比對。經(jīng)以上分析,在褐飛虱中腸內(nèi)共獲得5個具備Cry毒素受體功能的膜結(jié)合蛋白,包括2個APNs(bphAPN1、bphAPN4)、2 個 ALPs(bphALP4、bphALP6)和 1 個 Cadherin(bphCadherinl)，證明褐飛虱中腸上皮細(xì)胞膜上存在可能作為Cry毒素受體的APN、ALP及Cadherin蛋白。利用Bac to Bac?桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建能夠表達(dá)bphAPN4蛋白的桿狀病毒載體,并利用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞系Sf9對bphAPN4蛋白進(jìn)行真核表達(dá)。同時,將bphapn4基因序列、刪除GPI位點(diǎn)的bphapn4基因序列(bphAPN41ackG)和bphapnl基因序列分別插入pMT/BiP/V5-His載體中,并轉(zhuǎn)染入果蠅(Drosophlia)S2細(xì)胞系進(jìn)行真核表達(dá)。免疫印跡、共聚焦熒光顯微鏡觀察及蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果顯示bphAPNs蛋白分別在Sf9及S2細(xì)胞系中成功表達(dá),且bphAPN1蛋白和bphAPN4蛋白主要分布在細(xì)胞膜上,而bphAPN41ackG蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中,并分泌到胞外。以亮氨酸對硝基苯胺(leucinep-nitroanilide，leu-p-NA)為底物,僅在表達(dá)了bphAPN1蛋白的S2細(xì)胞中能夠檢測到氨肽酶活性(36.33±0.33)。Toxin-overlay實(shí)驗(yàn)及免疫熒光定位結(jié)果顯示S2細(xì)胞系中真核表達(dá)的bphAPN1和bphAPN4蛋白與CrylAc毒素?zé)o法特異性結(jié)合,而細(xì)胞生測結(jié)果顯示無論是表達(dá)bphAPN4蛋白的Sd9細(xì)胞還是分別表達(dá)bphAPN1和bphAPN4蛋白的S2細(xì)胞均對CrylAc毒素不敏感。此外,為探究CrylAb毒素domainll中3個loops在Cry毒素作用機(jī)制中的重要性,對3個受體識別loops分別被外源短肽P2S替換后的CrylAb重構(gòu)蛋白在胰蛋白酶水解作用下的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示loops的替換不會對CrylAb毒素的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性造成顯著影響。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)及競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與野生型CrylAb蛋白相比,3個CrylAb重構(gòu)蛋白與棉鈴蟲幼蟲中腸刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicle,BBMV)的結(jié)合沒有顯著變化,且同樣具有特異結(jié)合位點(diǎn)。Toxin-overlay結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)無論是野生型CrylAb毒素還是3個CrylAb重構(gòu)蛋白均和在S2細(xì)胞上表達(dá)的bphAPN1、bphAPN4蛋白無法特異性結(jié)合。而對棉鈴蟲幼蟲的生測結(jié)果顯示3個CrylAb重構(gòu)蛋白的毒性作用顯著低于野生型CrylAb毒素蛋白。其中l(wèi)oop2替換后的重構(gòu)蛋白L2RCM對棉鈴蟲幼蟲的毒性作用下降最為顯著,其次是L3RCM。上述結(jié)果表明在CrylAb毒素受體識別域中,loop 2的重要性高于loop1和loop3。在CrylA鱗翅目靶標(biāo)昆蟲中腸內(nèi),高表達(dá)并具有糖基錨定等特征的APN已被證明是CrylAc毒素的重要受體。本研究結(jié)果顯示,與鱗翅目中腸APN高度同源的bphAPN1和bphAPN4在褐飛虱中腸內(nèi)有較高的轉(zhuǎn)錄水平,且具備類似的糖基錨定膜蛋白的特征。CrylAc毒素?zé)o法與其特異性結(jié)合是造成褐飛虱對CrylAc毒素不敏感的重要因素之一。該結(jié)果為深入了解CrylAc毒素作用機(jī)制,了解CrylAc毒素對半翅目刺吸式口器害蟲水稻褐飛虱無明顯毒性作用的原因提供了依據(jù),也為通過分子改造等手段提升Cry毒素與昆蟲中腸上特定蛋白的親和活性從而獲得對褐飛虱等半翅目昆蟲具有毒性作用的新型Cry毒素的研究奠定了基礎(chǔ)。本研究的特色和主要創(chuàng)新點(diǎn)包括:證實(shí)褐飛虱中腸內(nèi)存在多個Cry毒素受體的同源蛋白;在兩種昆蟲細(xì)胞系中(Sf9和S2細(xì)胞)成功表達(dá)褐飛虱中腸上高轉(zhuǎn)錄水平的2個膜結(jié)合APN蛋白;對CrylAb毒素domain Ⅱ上3個受體識別loops在CrylAb毒性作用中重要性的差異程度進(jìn)行了分析;發(fā)現(xiàn)CrylA毒素與褐飛虱中腸上2個膜結(jié)合APN無明顯相互作用關(guān)系,從受體的角度分析CrylA毒素對褐飛虱無明顯毒性作用的原因。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S476.1
【部分圖文】：

圖１－１?Ｃｒｙ毒素三維空間結(jié)構(gòu)［９］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｒｅｅ?ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ?ｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ?ｏｆ?Ｃｒｙ?ｔｏｘｉｎｓ??形成過程中分泌出的Ｃｒｙ毒素被稱為原毒素不同＆￥原＿可以達(dá)到１３０ｋＤａ，如ＣｒｙｌＡ類毒素及Ｃｒｙ４Ｂ類毒素；有的、Ｃｒ３Ａ及ＣｒｌｌＡ在害蟲中

是完整且有重復(fù)的，４．４９％?（１２０個ＢＵＳＣＯｓ）是片段，１１．４０％?（３０５個ＢＵＳＣＯｓ）??未能查找到，該結(jié)果表明組裝數(shù)據(jù)的質(zhì)量是可用的。??對ＯＲＦ預(yù)測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，由ＯＲＦ長度分布圖可知（圖２－４），長度在??０－１００、１００－２００、２００－３００、３００－４００、４００－５００?區(qū)間以及大于?３０００?的?ＯＲＦ?數(shù)量均??在１０００個以上，長度在５００－３０００的ＯＲＦ數(shù)量呈現(xiàn)波動式減少，以２９００－３０００為??最低。ＯＲＦ長度統(tǒng)計表（表２－８）顯示，經(jīng)組裝總共獲得５３，０５３個ＯＲＦ，其長度??主要集中在０－３００，占總數(shù)７２．１３％的比例，長度在３００－５００、５００－１０００、１０００－２０００??的ＯＲＦ數(shù)量依次遞增

Ｂｏｍｂｙｘ?ｍｏｒｉ??Ｃｅｒａｐａｃｈｙｓ?ｂｉｒｏｉ??圖２－５褐飛鼠轉(zhuǎn)錄組Ｕｎｉｇｅｎｅｓ同源性分析??Ｆｉｇｕｒｅ?２－５?Ｈｏｍｏｌｏｇｙ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＢＰＨ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ?ｕｎｉｇｅｎｅｓ??對可與ＮＣＢＩ?ｎｒ數(shù)據(jù)庫中參‘基因匹配的ｌ８，８〇ｌ個Ｕｎｉｇｅｎｅｓ?（Ｅ?ｖａｌｕｅ?ｓ?１０－５）進(jìn)行Ｅ??值分布、序列相似性分布、物種分布統(tǒng)計分析。占比小于１％的部分未顯示??Ａｌｌ?ｄｉｓｔｉｎｃｔ?ｇｅｎｅ?ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ?（１８，８１０）?ｔｈａｔ?ｗｅｒｅ?ｈｉｔ?ｔｏ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｇｅｎｅｓ?ｉｎ?ＮＣＢＩ?ｎｒ?ｄａｔａｂａｓｅ?ｗｉｔｈ?ａ??ｃｕｔ－ｏｆｆ?ｏｆ?Ｅ－ｖａｌｕｅ?＜?１０?５?ｗｅｒｅ?ａｎａｌｙｚｅｄ?ｆｏｒ?Ｅ－ｖａｌｕｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，?ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｓｐｅｃｉｅｓ??ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．?Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ?ｌｅｓｓ?ｔｈａｎ?１％?ａｒｅ?ｎｏｔ?ｓｈｏｗｎ??２，３．２?Ｕｎｉｇｅｎｅｓ?的?Ｇ？注釋??ＧＯ數(shù)據(jù)庫是含有動物、植物、微生物在內(nèi)的１００多個物種的數(shù)據(jù)庳，可對??蛋白的功能進(jìn)行分類。整體上，ＧＯ分為３個不同的Ｏｎｔｏｌｏｇｉｅｓ，分別為細(xì)胞組??份（ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）、分子功能（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ）和生物．學(xué)途徑（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ??ｐｒｏｃｅｓｓ）。本研究根據(jù)這三大類將褐飛虱的Ｕｎｉｇｅｎｅｓ進(jìn)行功能分類，并將其進(jìn)??步劃分多個二級分類
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本文編號：2881547