發(fā)布時(shí)間：2020-11-16 15:53

　　 克氏原螯蝦(Procambarus clarkii),俗稱小龍蝦、紅螯蝦等,其食性雜、生長快且適應(yīng)力極強(qiáng),自上世紀(jì)三十年代傳入我國,因肉質(zhì)鮮美而深受人們喜愛,之后快速占據(jù)淡水蝦類經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的重要地位,現(xiàn)已成為世界上商品價(jià)值最大的蝦類之一。十幾年前南京的“龍蝦門”事件,使人們對克氏原螯蝦的病害情況開始有了重視,也吸引了越來越多的科研人士著手研究其染病、抗病等內(nèi)容。另外,隨著人們對克氏原螯蝦的熱情進(jìn)一步高漲,供不應(yīng)求的情況時(shí)有發(fā)生,這就迫使養(yǎng)殖戶更大規(guī)模地進(jìn)行養(yǎng)殖,隨之而來的也是克氏原螯蝦患病幾率的增加及感染病原體的多樣;而克氏原螯蝦同其他無脊椎動(dòng)物一樣,僅依靠先天免疫來防御病原入侵,因此對克氏原螯蝦先天免疫的研究更顯得尤為重要。本課題研究了Caspase-3C、Lectin和LGBP三種重要的免疫基因在克氏原螯蝦體內(nèi)的免疫功能,并得到以下結(jié)果:1、在克氏原螯蝦體內(nèi)克隆到一種半胱氨酸蛋白酶基因,命名為PcCaspase-3C,該基因全長4684 bp,其包含一個(gè)1572 bp的開放閱讀框(ORF),編碼523個(gè)氨基酸。該蛋白含有一個(gè)由237個(gè)氨基酸組成的CASc結(jié)構(gòu)域和一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域。該基因主要表達(dá)于心臟、胃和腸道,在肝胰腺和鰓中表達(dá)量較低,在血細(xì)胞中表達(dá)最少。受金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌或白斑綜合征病毒(WSSV)刺激后,PcCaspase-3C在腸、胃中的表達(dá)水平均有不同程度的上調(diào)。將該基因干擾后,再用副溶血弧菌刺激克氏原螯蝦,發(fā)現(xiàn)有部分抗菌肽的表達(dá)被抑制,如ALF2、ALF5、ALF6、Cru4和Lys。將該基因敲低后,用WSSV感染克氏原螯蝦,WSSV的拷貝數(shù)有明顯增加。根據(jù)以上結(jié)果,推測PcCaspase-3C在克氏原螯蝦抗細(xì)菌和抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。2、C型凝集素作為一類模式識別受體(PRRs)在甲殼動(dòng)物的先天免疫中發(fā)揮重要作用。在本研究中,我們在克氏原螯蝦中發(fā)現(xiàn)了一種新的凝集素基因(PcLectin),該基因全長1025 bp,包括528 bp的ORF,編碼175個(gè)氨基酸的蛋白。PcLectin蛋白含有一個(gè)信號肽和一個(gè)糖識別結(jié)構(gòu)域(CRD)。該基因在胃中表達(dá)水平最高,在肝胰腺中表達(dá)較少,在其他組織中幾乎不表達(dá)。在感染金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌或WSSV的蝦中,PcLectin的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。將該基因敲低后,用副溶血弧菌刺激克氏原螯蝦,部分抗菌肽的表達(dá)被抑制(ALF2、ALF6、Cru2、Cru4)。將該基因進(jìn)行體外原核重組表達(dá),發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的蛋白對幾種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和多糖均具有結(jié)合活性,且能以Ca~(2+)依賴的方式凝集細(xì)菌。綜合以上結(jié)果,我們認(rèn)為,PcLectin參與了克氏原螯蝦先天免疫防御。3、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)作為一種模式識別受體,參與無脊椎動(dòng)物先天免疫。本研究中,我們在克氏原螯蝦體內(nèi)克隆到一個(gè)LGBP基因,全長1327 bp,包括1113 bp的ORF,編碼由370個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),其含一個(gè)信號肽、一個(gè)糖苷水解酶活性結(jié)構(gòu)域(Glyco_hydro_16)和一個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域。經(jīng)過研究,發(fā)現(xiàn)該基因在不同組織中的表達(dá)存在性別差異,在健康的克氏原螯蝦體內(nèi),在雌蝦各種組織中的表達(dá)量幾乎都低于雄蝦。無論是雌蝦還是雄蝦,都是在肝胰腺中表達(dá)最高,其他組織中表達(dá)較少,腸道中表達(dá)最少。經(jīng)副溶血弧菌或脂多糖(LPS)刺激后,該基因在雌體和雄體中的變化情況亦有差異,但在胃和肝胰腺中的表達(dá)整體呈上升趨勢。在雄蝦的肝胰腺中,將PcLGBP基因敲低后,多種抗菌肽基因的表達(dá)都受到抑制。體外重組表達(dá)的LGBP蛋白(rPcLGBP),對LPS、Glu和PGN都有不同程度的結(jié)合活性,并且可以結(jié)合多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。酚氧化酶活性測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在正常雄蝦的肝胰腺、鰓和胃中,其酚氧化酶活性均顯著高于雌蝦。在雄蝦肝胰腺中,將PcLGBP敲低后,酚氧化酶活性降低。重組的LGBP蛋白和β-1,3-葡聚糖(Glu)或LPS孵育后可以明顯提高肝胰腺的酚氧化酶活性。以上結(jié)果表明LGBP不僅可以參與抗菌肽基因的表達(dá)調(diào)控,還可以參與酚氧化酶的活化;在雄蝦體內(nèi),其表達(dá)水平較高,賦予雄蝦較高的酚氧化酶活性。
【學(xué)位單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

第一章 緒 論得尤為重要[25]。如圖 1.1 所示，當(dāng)模式識別受體識別病原微生物表面的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan，Glu）等多糖時(shí)[26-28]，廣泛存在于血液和甲殼內(nèi)層組織中的酚氧化酶原便被特異性激活，并被水解為有活性的酚氧化酶，進(jìn)而促進(jìn)單酚逐步氧化成聯(lián)苯酚和具有毒性的醌，而醌會(huì)自發(fā)地生成黑色素，并與黑色素一起參與防御反應(yīng)，殺滅入侵的病原，[22,29]；其中防御過程包括提供調(diào)節(jié)因子、促進(jìn)血細(xì)胞吞噬作用、包囊作用和結(jié)節(jié)的形成[25]，同時(shí)也可以介導(dǎo)凝集和凝固，產(chǎn)生殺菌物質(zhì)（溶菌酶等）[30]。這種反應(yīng)非常劇烈且高效，機(jī)體為了防止錯(cuò)誤地合成有毒物質(zhì)醌，也發(fā)展出很嚴(yán)密的調(diào)控機(jī)制。在甲殼動(dòng)物體內(nèi)，酚氧化酶原主要由成熟血細(xì)胞（顆粒細(xì)胞或半顆粒細(xì)胞）產(chǎn)生并貯存，一旦被微生物表面的多糖或者脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白、β-葡聚糖結(jié)合蛋白等觸發(fā)，就會(huì)以脫顆粒的方式釋放到血漿中，隨后被水解并在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的級聯(lián)反應(yīng)，其中蛋白酶抑制劑可以限制這種級聯(lián)反應(yīng)，從而確保此反應(yīng)不會(huì)因?yàn)檫^早或過激發(fā)生而危害機(jī)體[29, 31]。

起始 caspase 再對執(zhí)行者 caspase 進(jìn)行切割并使之激活，被激活的執(zhí)行者 caspase對 caspase 靶蛋白進(jìn)行水解，最終導(dǎo)致細(xì)胞的程序性死亡（圖 1.2）。在大多數(shù)生物體中，細(xì)胞凋亡是抵御病原菌、維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)的重要生物學(xué)過程之一[65, 73]。細(xì)胞凋亡通常由兩種途徑引起，一種是 caspase-8 介導(dǎo)的外源性凋亡通路，另一種是 caspase-9 激活介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路，兩者都能激活caspase-3[71,74,75]。然而，只有一部分病原體會(huì)被凋亡通路抑制其復(fù)制，而另一部分可能已經(jīng)進(jìn)化出一些防御和反應(yīng)機(jī)制，不會(huì)受到凋亡的影響[73,76-79]。在無脊椎動(dòng)物中。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，蝦感染對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）之后，其體內(nèi)的 caspase-3 基因的活性大幅增加[80]。比如墨吉明對蝦感染 WSSV 后，其caspase-3 基因表達(dá)水平有一定提升[81]；日本囊對蝦體內(nèi)的 PjCaspase 基因在病毒感染后表達(dá)上調(diào)，被敲除后，其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受到明顯抑制[76]。據(jù)報(bào)道，經(jīng)病原微生物感染后，蝦體中可檢測到大規(guī)模的細(xì)胞凋亡，這種凋亡的增加最終會(huì)導(dǎo)致蝦體的死亡[80, 82, 83]。一些研究證實(shí)，消除 caspase 活性可以減少細(xì)胞凋亡[84]，而 caspase-3 是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控元件[69]，所以敲除 Caspase-3 可能會(huì)提高蝦的存活率[79]。

第二章 克氏原螯蝦體內(nèi) Caspase-3C 基因的克隆與功能研究Fig. 2.1 (A-B) Nucleotide and deduced amino acid sequence of PcCaspase-3C from P. clarkii.Deduced amino acid residues are numbered on the right. Alow complexity region sequence isunderlined, and the CASc domain is in gray. The initiation codon (ATG) is marked in red. (C)Domain structure of PcCaspase-3C.標(biāo)記。（C）PcCaspase-3C 的結(jié)構(gòu)域示意圖。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 韓珂珂;克氏原螯蝦三個(gè)免疫相關(guān)基因Caspase-3C、Lectin和LGBP的功能研究[D];南京師范大學(xué);2019年

本文編號：2886415