發(fā)布時間：2020-11-20 03:18

　　 團頭魴(Megalobrama amblycephala)是我國特有的經濟淡水魚類之一,但是隨著團頭魴養(yǎng)殖密度的增加以及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化,導致其抗病能力降低,病害頻發(fā),尤其是由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的細菌性敗血癥嚴重影響了團頭魴養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,造成了巨大的經濟損失,為了解決魚類養(yǎng)殖中病害多發(fā)的問題,越來越多的研究學者開始研究魚類的免疫應答反應及其調控機制。因此,本研究通過對團頭魴Toll樣受體(toll like receptors,tlrs)及干擾素調節(jié)因子(interferon regulatory factors,irfs)基因表達及其功能等方面進行分析,有利于掌握其在調節(jié)團頭魴抗細菌免疫應答中的作用,為魚類細菌性疾病的預防和治療提供基礎參考資料。本研究主要結果如下:1.鑒定出4個能夠特異性識別細菌組分的tlrs基因,分別為團頭魴tlr5a(Matlr5a)、Matlr5b、Matlr9和Matlr21。序列分析表明,4個MaTlrs都具有典型的TLR蛋白結構特征,包括胞外LRR(Leucine-rich repeat)結構區(qū)域,胞內TIR(Toll/interleukin-1 receptor)結構區(qū)域及跨膜TM(Transmembrane)結構區(qū)域,并預測了胞外LRRCT結構域和胞內TIR結構域的蛋白質3D結構,分析發(fā)現(xiàn)二者均呈現(xiàn)較為保守的結構特征,并且LRRCT結構域符合α螺旋和β折疊串聯(lián)結構的特征。系統(tǒng)進化分析顯示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21分別屬于TLR5亞家族,TLR7亞家族和TLR11亞家族。利用熒光定量PCR方法檢測Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在組織中的表達量,結果顯示,其在所有檢測的組織中均有表達,并且在免疫器官和淋巴樣組織中的表達量相對較高。此外研究還發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌可以有效的誘導Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21基因在感染后團頭魴的肝臟、脾臟、腎臟、腸和鰓中上調表達。2.克隆得到11個團頭魴irfs(Mairfs)基因,利用Clustal W和SMART在線分析蛋白質序列特征,結果顯示,這11個蛋白質都屬于非跨膜蛋白并且無信號肽序列,除了MaIrf1和MaIrf2,其余MaIrfs都含有兩個保守功能域:IRF和IRF3功能域。預測11個MaIrfs蛋白質的氨基端和羧基端3D結構,結果顯示,同一家族的Irfs因子蛋白質的氨基端結構幾乎一樣,顯示出極高的保守性。系統(tǒng)進化分析顯示11個MaIrfs分別屬于IRF1亞家族,IRF3亞家族,IRF4亞家族和IRF5亞家族。利用熒光定量PCR方法檢測了11個Mairfs基因在組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)其在所有檢測的組織均有表達,而且在免疫器官和淋巴樣組織中的表達量相對較高。研究還發(fā)現(xiàn),嗜水氣單胞菌感染團頭魴后,可以有效的調控這些基因在肝臟、脾臟、腎臟、腸和鰓中的表達變化,參與機體抗嗜水氣單胞菌的免疫應答。通過原核表達系統(tǒng)獲得團頭魴核因子κB抑制蛋白β(MaIκB-β)可溶性蛋白,以及MaIrf1和MaIrf2不可溶蛋白,并對其進行抗菌性試驗,結果顯示獲得的MaIκB-β可溶性蛋白在體外試驗中并沒有抗菌作用,但Western-Blot(WB)和Immuno-Fluorescence(IF)試驗結果顯示在嗜水氣單胞菌感染的過程中,干擾素調節(jié)因子與炎癥因子都參與了抗菌免疫應答。3.通過構建真核表達質粒,在鯉EPC細胞研究了團頭魴4個Matlrs在信號傳導過程中功能的相似性及差異性,利用GFP融合蛋白對其進行亞細胞定位,激光共聚焦結果顯示MaTlr5a、MaTlr5b、MaTlr9和MaTlr21蛋白質都位于細胞質中,其中MaTlr5a和MaTlr5b與早期內涵體和晚期內涵體位于不同位置,而MaTlr9和MaTlr21與早期內涵體和晚期內涵體都位于同一位置。利用過表達載體研究Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21全長基因對干擾素相關免疫因子的轉錄調控,結果表明其均能誘導irf3、irf7、isg15、mx1、pkr和viperin的上調,說明團頭魴4個Matlrs的信號傳導過程是相似的,但是其上調的時間與上調基因表達量的程度是不同的,對viperin、isg15和irf7上調程度較高,pkr上調程度最小,而且Matlr5b最先調控干擾素通路,可能發(fā)揮主要功能,Matlr21最后調控,可能在信號傳導過程中發(fā)揮輔助作用。因此它們在執(zhí)行功能中可能有差異,但是都能夠參與機體抗病原體的免疫應答。4.利用克隆方法獲得6個Mairfs啟動子序列,序列分析發(fā)現(xiàn)其啟動子序列中都有核轉錄因子κB(NF-κB)位點。利用雙熒光素酶報告試驗探究了Matlrs對Mairfs啟動子的調控關系,而且在人類293T細胞和鯉EPC細胞這兩種細胞系中得到的結果相似,說明此信號傳遞的過程不受物種限制。雙熒光素酶報告試驗結果顯示團頭魴Matlr5a和Matlr9能夠促進Mairf7啟動子活性,但是不能促進其他基因的啟動子活性;Mairf5b能夠促進Mairf1和Mairf7啟動子的活性,而Matlr21并不能促進任何Mairfs啟動子活性,說明Matlrs對Mairfs啟動子的調控較為復雜。利用細胞凋亡試驗研究過表達Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21后,在細菌感染細胞過程中對細胞凋亡的調控,試驗結果顯示MaTlr5a,MaTlr9和MaTlr21都能夠在一定程度上抑制了細胞凋亡,而MaTlr5b在一定程度上促進了細胞凋亡。綜上所述,在團頭魴Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21以及Mairf1、Mairf2、Mairf3、Mairf4a、Mairf4b、Mairf5、Mairf6、Mairf7、Mairf8、Mairf9和Mairf10在抵抗嗜水氣單胞菌感染過程中能夠調控機體免疫,通過二者的相互作用,能夠更好的保護機體免受病原體的入侵,但是Matlr5a、Matlr5b、Matlr9和Matlr21在信號傳導及行使功能過程中具有一定的差異,這為進一步探究魚類Tlr及Irf信號通路在抗細菌過程中的調控奠定基礎。
【學位單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

團頭魴 tlrs 及 irfs 基因的克隆、表達及其功能研究據(jù) TLRs 識別的 PAMPs 不同，其細胞定位也不同，且具有特異性。 般原體表成分的 TLRs 都定位在細胞膜上，而識別病原核酸成分的 TLR器膜上（如內體膜）（AgrawalandKandimalla2007），如 TLR3、7、8、化的細胞定位，對 TLRs 與特異性配體結合及細胞內信號轉導都起到作用（BartonandKagan2009）。盡管魚類有 些特殊的 Tlr 存在，但是物中 TLR 級聯(lián)招募的下游接頭分子相似并且信號傳導功能 致（圖 1家對比較低等脊椎動物和哺乳動物先天和適應性免疫防御機制的研究。

RAM 和 SARM（Akira et al 2006）。所有的 IRFs 氨基端均包含 D，能夠識別干擾素及干擾素刺激基因相似的DNA序列（Escalante TLR 介導的下游信號通路主要是兩條：MyD88 依賴型和 MyD88-TRIF 依賴途徑）信號通路，所有 TLRs 均激活 MyD88 依賴通路3 和 TLR4 還可以激活 MyD88 非依賴通路。比如，TLR4 在 MyD88 非依賴型信號通路中均能發(fā)揮作用，TLR4 可以通過誘導 MyD激活 IFN-β 的產生，如果沒有完全激活，則可以通過 MyD88 非依在 TLR4 調控炎癥細胞因子誘導基因（如 TNF 和 IL-6）活化時，途徑來完全激活。而且這兩條途徑都與下游的兩條信號通路的活 MAPK 信號通路。前有大量研究表明， 些 IRF 家族成員也能被 MyD88 依賴和 My活，并對 TLRs 誘導的特定基因的表達起到協(xié)同作用，所以，IRFs TRIF 依賴型信號通路中發(fā)揮重要作用（圖 1-2）。

表Matlr9-qF CACAACCGCATTGACCTGTATlr9Matlr9-qR CGATGTCCCATACCCTTCATMatlr21-qF TCGCAGTGAATGGTGCTCTlr21Matlr21-qR GGACAGTTGCCGCTTAGGTAβ-actin-F ACCCACACCGTGCCCATCTAβ-actinβ-actin-R CGGACAATTTCTCTTTCGGCTGMatlr5a-F ATGGCAACAAGATGCACTTTATCTTlr5aPCRMatlr5a-R TTACACTGCAGTGTCTGCTTGCAMatlr5b-F ATGGGATTTACATTCATTCTGATCCTlr5bMatlr5b-R TTATACTGCTGTGTTTGCATGGACAMatlr9-F ATGTTTGGATACGTGTATTTGATTCTCTlr9Matlr9-R TTAGAAGAAGCTCTCTATGACATTTTTGMatlr21-F ATGGCAGCTTCTGCATGTCGTlr21Matlr21-R TCAGGGCATTAGGTAATACTCTTCC
【參考文獻】

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本文編號：2890861