發(fā)布時間：2020-11-20 13:01

　　 十足目虹彩病毒1感染(Infection with Decapod iridescent virus 1,IDIV1),是一種能夠?qū)е录讱�動物高死亡�?可達(dá)100%)的新發(fā)疫病。該病的病原為十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1),目前包含兩個病毒株,即:蝦血細(xì)胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus,SHIV)和紅螯螯蝦虹彩病毒(Cherax quadricarinatus iridovirus,CQIV)。這兩株病毒的基因組相似性為99%。其中,SHIV由本實(shí)驗(yàn)室首次完成分離、鑒定、測序分析、命名及檢測方法建立等一系列工作。IDIV1首先發(fā)生于中國福建,2017年,我國正式啟動DIV1的監(jiān)測計(jì)劃,涉及13個省(直轄市)。其中,6個省出現(xiàn)了IDIV1疫情。目前還沒有控制IDIV1傳播的良好措施。本論文旨在調(diào)查、評價不同甲殼動物對DIV1感染的敏感性,初步揭示DIV1的易感宿主和生物載體,從而為IDIV1的疫病防控和甲殼動物的健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)。1.脊尾白蝦對十足目虹彩病毒1的易感性研究本研究中,通過投喂DIV1(SHIV 20141215)感染的凡納濱對蝦病料和注射病毒粗提液(注射感染)的方式人工感染脊尾白蝦。感染后的脊尾白蝦表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,包括額劍基部出現(xiàn)輕微“白頭”、活力減弱、空胃、肝胰腺顏色變淺、空腸和死亡,投喂組、注射組和對照組的累計(jì)死亡率分別為(50.0±26.5)%、(76.7±18.3)%和6.7%。TaqMan探針法實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示,死亡的和具有典型臨床癥狀的脊尾白蝦均為DIV1陽性。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),被感染的脊尾白蝦的肝胰腺血竇、造血組織和甲殼下上皮存在嗜酸性包涵體和核固縮現(xiàn)象,并且部分嗜酸性包涵體里面或周圍有微小的嗜堿性染色。原位地高辛標(biāo)記的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(in situ DIG-labeling-loop-mediated DNA amplification,ISDL)檢測發(fā)現(xiàn),被感染的脊尾白蝦的胃、造血組織、甲殼下上皮組織和肝胰腺血竇中都觀察到藍(lán)紫色陽性雜交信號。采用透射電鏡對感染的脊尾白蝦各組織超薄切片觀察發(fā)現(xiàn),在肝胰腺血竇、鰓、步足、肌肉和游泳足的血細(xì)胞中存在大量的二十面體病毒粒,直徑約150 nm,成熟的病毒粒子主要分布在細(xì)胞膜附近的細(xì)胞質(zhì),位于病毒發(fā)生基質(zhì)的邊緣。綜合以上分子生物學(xué)、組織病理和透射電鏡的檢測結(jié)果,表明脊尾白蝦是DIV1的一種易感宿主。2.三疣梭子蟹等多種甲殼動物對十足目虹彩病毒1的易感性調(diào)查本研究通過投喂或注射攻毒方式對三疣梭子蟹、中華錦繡龍蝦、天津厚蟹和寄居蟹進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn),通過投喂吸附DIV1(SHIV 20141215)的小球藻進(jìn)行鹵蟲的人工感染實(shí)驗(yàn)。其中,三疣梭子蟹能夠被DVI1成功感染,而天津厚蟹、寄居蟹和錦繡龍蝦中均未檢測到SHIV感染。被感染的三疣梭子蟹表現(xiàn)出活力減弱、空胃、空腸和死亡,且上皮、性腺、鰓、心臟、肝胰腺、胃、肌肉和腸等組織經(jīng)qPCR檢測均為DIV1強(qiáng)陽性;組織病理上呈現(xiàn)核固縮及嗜酸性包涵體;對以上各組織的ISDL檢測同樣都觀察到了藍(lán)紫色陽性信號;通過透射電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)在以上各組織的細(xì)胞內(nèi)外存在大量的二十面體病毒粒子,大小約136.4±16.1 nm(n=90)。鹵蟲攻毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,DIV1在鹵蟲體內(nèi)的病毒載量隨感染時間增加而降低。攻毒后1天,DIV1在鹵蟲體內(nèi)的載量達(dá)到10~6 copies/ng-DNA,但在攻毒后7天,DIV1在鹵蟲體內(nèi)的檢測呈陰性。另外,ISDL的結(jié)果表明,在攻毒3天后的鹵蟲樣品檢測到藍(lán)紫色陽性信號,僅分布在附肢周圍,但在攻毒7天后的鹵蟲樣品中未檢測到陽性信號。以上結(jié)果表明,三疣梭子蟹是DIV1的一種易感宿主,而天津厚蟹、寄居蟹、鹵蟲、錦繡龍蝦均不是DIV1的易感宿主。3.一例羅氏沼蝦自然感染十足目虹彩病毒1的病例研究羅氏沼蝦是一種重要的淡水養(yǎng)殖動物。近年來,羅氏沼蝦養(yǎng)殖場暴發(fā)的一種新疾病,俗稱“白頭”病,在中國造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,但尚未明確“白頭”病的病原。在本研究中,我們從江蘇省某暴發(fā)“白頭”病的羅氏沼蝦養(yǎng)殖場,采集了羅氏沼蝦、日本沼蝦、克氏原螯蝦、細(xì)螯沼蝦、凡納濱對蝦和一些枝角類樣品,并進(jìn)行了病原學(xué)分析。這些樣品的qPCR檢測均為DIV1陽性。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),羅氏沼蝦和日本沼蝦的造血組織、肝胰腺和鰓中存在嗜酸性包涵體和核固縮現(xiàn)象;另外,在它們的造血組織、血細(xì)胞、肝胰腺和觸角腺中也檢測到ISDL的藍(lán)紫色陽性雜交信號。此外,在羅氏沼蝦造血組織的超薄切片中發(fā)現(xiàn)大量DIV1粒子,平均直徑約157.9 nm,并在血細(xì)胞中觀察到病毒裝配區(qū)和正在出芽的病毒。通過TaqMan PCR定量檢測DIV1在羅氏沼蝦不同組織中的病毒分布,結(jié)果表明DIV1在造血組織中分布量最高,相對豐度為(25.4±16.9)%;肝胰腺和肌肉中的分布量最低,相對豐度分別為(2.4±1.2)%和(2.4±2.2)%。綜合以上結(jié)果,我們初步判定DIV1是羅氏沼蝦“白頭”病的病原,日本沼蝦和克氏原鰲蝦也是DIV1的自然宿主。綜上所述,本論文的研究結(jié)果表明:(1)羅氏沼蝦、日本沼蝦、克氏原螯蝦、脊尾白蝦和三疣梭子蟹是DIV1的易感宿主,而天津厚蟹、寄居蟹、鹵蟲和錦繡龍蝦并非DIV1的宿主;(2)感染DIV1的甲殼動物呈現(xiàn)活力減弱、空腸、空胃等臨床癥狀,被感染的脊尾白蝦和羅氏沼蝦的臨床癥狀還表現(xiàn)為額劍基部造血組織發(fā)白,即“白頭”癥狀;(3)在組織病理上,被感染的肝胰腺、鰓等組織存在嗜酸性包涵體、發(fā)生核固縮現(xiàn)象,在嗜酸性包涵體的里面或周圍存有嗜堿性微粒。本論文的相關(guān)研究結(jié)果,將有助于DIV1致病機(jī)制和IDIV1疫病防控技術(shù)的深入研究,為IDIV1疫病傳播控制措施的制定提供技術(shù)指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S941.41
【部分圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文照組之間差異極顯著（P<0.01）。三參數(shù) Sigmoid 方程的非線性回歸，注射和投喂感染 DIV1 的( )=70.77±0.211+ (4.76±2.49) (2.64±0.21)（公式 2-2） ( )=42.52±1.221+ (0.82±0.51) (3.83±0.87)（公式 2-3）數(shù)中可知，通過肌肉注射感染 DIV1 導(dǎo)致的累計(jì)死亡率是（70.7染導(dǎo)致的累積死亡率是(42.52±1.22)%。注射組達(dá)到最高累計(jì)死間是（2.64±0.21）dpi，瞬時發(fā)病率為（4.76±2.49/天；投喂組在（3到最大累計(jì)死亡率的一半，瞬時發(fā)病率為（0.82±0.51/天。

15圖 2-4 DIV1 陰性和陽性感染脊尾白蝦的 HE 染色圖。黑色箭頭指示核固縮，白色箭頭指示嗜酸性包涵體。肝胰腺（a 和 b）；造血組織（c 和 d）；甲殼下上皮（e 和 f），在脫水前已經(jīng)去除角質(zhì)層。 a，c 和 e 是 DIV1 陽性脊尾白蝦的組織; b，d 和 f 是對照蝦的組織。HpT：肝胰管；HpS：肝胰竇；Hm：造血組織；Ep：上皮；Cn：結(jié)締組織；m：有絲分裂期。標(biāo)尺=50 μmFigure.2-4 Histopathological examination of E. carinicauda tissues infected with DIV1 andcontrols. Black arrows show the karyopyknosis and white arrows show the eosinophilic inclusions.Hepatopancreas （a and b）; hematopoietic tissues （c and d）, and cuticular epithelium （e andf） on which the cuticles were removed before dehydration. The pictures in the left column （a, c,and e）are the tissues of the infected prawn; the pictures in the right column（b, d, and f）are the

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文tissues of the control prawn. HpT: hepatopancreatic tubule; HpS: hepatopancreatic sinus; Hm:haematopoietic tissue; Ep: epithelium; Cn: connective tissue; m: mitotic phase. Bar = 50 μm2.3.4 LAMP 引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)針對 DNA-directed RNA polymerase II second largest subunit 基因設(shè)計(jì) LAMP引物，擴(kuò)增序列位于SHIV20141215基因組全長序列（GenBank序列號：MF599468）的 69047-69263 位置，其序列與 CQIV CN01 的 77416-77200 的序列完全匹配（圖5）。另外，LAMP 引物特異性檢測結(jié)果顯示，這個反應(yīng)只有對 DIV1 感染的蝦的顯示陽性，而對 WSSV，AHPND，IHHNV 或 EHP 感染的蝦，反應(yīng)均為陰性。 這表明本研究中的 LAMP 引物特異于 DIV1，可用于 ISDL。
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本文編號：2891454