發(fā)布時間：2020-11-20 23:58

　　 斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富、成長快等特點,目前為東南亞海域及中國南海海域重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)種類。但近年來由于海洋環(huán)境污染日趨嚴(yán)重,水體微生物等物質(zhì)經(jīng)常嚴(yán)重超標(biāo),致使斑節(jié)對蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展因此受到嚴(yán)重影響。其中哈維弧菌是一種廣泛存在于海洋環(huán)境中可以感染甲殼類、魚類、貝類的條件致病菌,易引發(fā)突眼、慢性皮膚潰瘍、敗血癥等動物病癥,而細(xì)胞自噬可吞噬細(xì)菌或者病毒,對細(xì)胞免疫有重要的意義。在細(xì)菌與宿主互作中基因表達(dá)調(diào)控起非常重要的作用,miRNA是調(diào)控基因表達(dá)的重要因子,故研究miRNA調(diào)控細(xì)胞自噬基因在哈維弧菌刺激下的作用就很有意義。本實驗利用已構(gòu)建的斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出ATG5和ATG12 EST序列,用primer軟件設(shè)計特異性引物,PCR進(jìn)行ORF驗證,利用RACE技術(shù)擴增得到ATG5和ATG12基因的3’末端,以此得到兩個基因的全長。確定了斑節(jié)對蝦ATG5和ATG12基因在不同組織中的表達(dá)分布規(guī)律;對靶向調(diào)控ATG5和ATG12的miRNA進(jìn)行了篩選,并利用雙熒光素報告實驗進(jìn)行了驗證;利用熒光定量PCR的方法及western blot免疫印跡等方法對ATG5、ATG12與miR-7562在哈維弧菌應(yīng)激下的表達(dá)調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了研究,并初步對由哈維弧菌應(yīng)激所產(chǎn)生的細(xì)胞自噬、miR-7562及ATG5-ATG12共軛系統(tǒng)之間關(guān)聯(lián)情況進(jìn)行了鑒定,具體研究結(jié)果如下:(1)PmATG5基因序列cDNA主要為5’-UTR包含114 bp、1357 bp 3’-UTR和一個編碼269個氨基酸的810 bp開放閱讀框。PmATG5分子量為31.125 kDa,其理論等電點為5.66。PmATG12基因序列cDNA全長1101bp,包含363 bp的ORF,16 bp的5’-UTR和722 bp的3’-UTR。開放閱讀框編碼120個氨基酸,分子量為13.59 kDa,理論等電點為6.12。PmATG5和PmATG12在斑節(jié)對蝦各個組織中均有表達(dá),在肌肉組織中表達(dá)量最高,且兩者的表達(dá)模式有一定的相似性。序列比對結(jié)果顯示,PmATG5氨基酸序列與藍(lán)蟹的ATG5一致性高達(dá)87%,PmATG12的序列則與家蠶有較高的一致性。表明兩者在進(jìn)化上都高度保守,ATG5和ATG12對機體有十分重要的作用。(2)miRNA的篩選:靶基因預(yù)測使用的為mireap,miranda,targetscan三個軟件,miRNA靶基因預(yù)測的結(jié)果是取三個軟件的交集。從本實驗室已有的小RNA文庫篩選調(diào)控ATG5和ATG12的miRNA,共有22種miRNA調(diào)控ATG5,有24種miRNA調(diào)控ATG12,共同調(diào)控PmATG5和PmATG12基因的有三種,分別是mir-7562,mir-8485,mir-278。當(dāng)斑節(jié)對蝦受到哈維弧菌刺激時,miR-278和miR-7562在6h和24h均有明顯的下調(diào),PmATG5的相對表達(dá)量在72h達(dá)到最高,約為對照組的3.8倍,而PmATG12的相對表達(dá)量在哈維弧菌應(yīng)激72h時達(dá)到最高,約為對照組的1.6倍,miRNA的表達(dá)與PmATG5和PmATG12表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素報告結(jié)果顯示:miR-7562可以調(diào)控帶有ATG5 3’UTR的熒光素的表達(dá)(p0.0001);而在結(jié)合位點突變后,這種調(diào)控關(guān)系減弱(p=0.0022),減弱9.3%。由此證實miR-7562可能通過該結(jié)合位點調(diào)控?zé)晒馑氐谋磉_(dá)。miR-7562可以調(diào)控帶有ATG12 3’UTR的熒光素的表達(dá)(p0.0001);而在結(jié)合位點突變后,這種調(diào)控關(guān)系明顯減弱(p=0.0246),減弱46.2%。miR-7562可以調(diào)控帶有ATG5 3’UTR的熒光素的表達(dá)和ATG12 3’UTR的熒光素的表達(dá)。(3)miRNA通過調(diào)節(jié)ATG5、ATG12的轉(zhuǎn)錄水平介導(dǎo)細(xì)胞自噬。過量表達(dá)miR-7562可使PmATG5在24h和48h的相對表達(dá)量下調(diào),約為對照組的0.67倍和0.81倍,可使PmATG12相對表達(dá)量明顯下調(diào),在24h時約為對照組的0.62倍;沉默miR-7562可使PmATG5和PmATG12相對表達(dá)量上調(diào),分別在24h顯著高于對照組2.2倍和1.43倍。免疫印跡結(jié)果顯示:過量表達(dá)miR-7562后,在48h斑節(jié)對蝦細(xì)胞自噬水平下降;沉默miR-7562后,在48h斑節(jié)對蝦細(xì)胞自噬水平明顯升高。(4)哈維弧菌刺激下,miR-7562調(diào)節(jié)的PmATG5和PmATG12在細(xì)胞自噬中的作用。熒光定量PCR結(jié)果顯示斑節(jié)對蝦受到哈維弧菌刺激后,過表達(dá)miR-7562(miR-7562-agomir)的斑節(jié)對蝦的PmATG5的相對表達(dá)量在24h與(V.harveyi+NCM)對照組相比明顯下調(diào),而PmATG12相對表達(dá)量在注射6h和24h時與(V.harveyi+NCM)組相比表現(xiàn)下調(diào),蛋白定量結(jié)果表明,斑節(jié)對蝦的細(xì)胞自噬較對照組相比在48h和72h明顯下調(diào);沉默miR-7562(miR-7562-antagomir)的斑節(jié)對蝦的PmATG5在24h相對表達(dá)量與(V.harveyi+NCI)對照組比明顯上調(diào),而PmATG12在注射6h和24h時與(V.harveyi+NCM)對照組相比相對表達(dá)量表現(xiàn)上調(diào),蛋白定量結(jié)果表明,斑節(jié)對蝦在48h、72h細(xì)胞自噬程度較對照組明顯上調(diào)。在哈維弧菌刺激下,無論是干擾ATG5/ATG12單個基因的表達(dá),還是同時干擾ATG5和ATG12的表達(dá),細(xì)胞自噬水平較對照組都明顯下調(diào)。種種結(jié)果都表明,miR-7562調(diào)控的細(xì)胞自噬相關(guān)基因ATG5和ATG12在哈維弧菌刺激斑節(jié)對蝦下調(diào)控其細(xì)胞自噬。
【學(xué)位單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S945.47
【部分圖文】：

圖 1-1 細(xì)胞自噬形成過程 自噬體伸長過程中，Atg5-Atg12 占據(jù)重要位置，從自噬體，自噬體膜不斷延長，至包裹并封閉鄰近的目標(biāo)及胞漿，然后與溶酶體融合后吞噬物質(zhì)δ兩類泛素共軛體系參與自噬體的擴，即 lc3-PE 和 ATG5-ATG12 共軛體Figure 1-1.The process of the formation of autophagy. ATG5 is one of the key players dautophagosome elongation. Starting from the autophagosome formation site, the autophagelongated, sealed around neighboring targets, and then fused with a lysosome to allowdegradation of the engulfed contents. Two ubiquitin-like conjugation systems are involveexpansion of autophagosome: ATG5-ATG12 and LC3-PE1.4 miRNA 簡介miRNA(microRNA)是近年來研究非常多的一類非編碼小 RNA（ncRN估計，miRNA 能夠在翻譯水平上調(diào)節(jié)人類基因組中高達(dá) 60%的基因編碼的由于 miRNA 在基因調(diào)控中的普遍作用，它們參與到許多生理過程，如分化

圖 2-5 PmATG12 系統(tǒng)進(jìn)化樹δ使用 Clustal W 及 MEGA6 多重比對并建立 NJ 進(jìn)化樹δ相關(guān)ATG12 GenBank 注冊號如下：黑脈金斑蝶 Danaus plexippus EHJ78946.1, 家蠶 Bombyx moriNP_001135963.1, 樺尺蛾 Biston betularia ADO32996.1, 斑馬魚 Danio rerio AAI54047.1, 美國短吻鱷 Alligator mississippiensis KYO48830.1, 斑胸草雀 Taeniopygia guttata ACH43616.1δFig.2-5 Phylogenetic analyses of PmATG12. Amino acid sequences alignment were producedby Clustal W, and we used the MEGA 6 to build neighbor-joining phylogeny tree. GenBankaccession numbers encoding ATG12 are as follows: Danaus plexippus EHJ78946.1, Bombyx moriNP_001135963.1, Biston betularia ADO32996.1,Danio rerio AAI54047.1, Alligatormississippiensis KYO48830.1, Taeniopygia guttata ACH43616.1。PmATG5 氨基酸序列顯示其與藍(lán)蟹（CAJ31266.1）的 ATG5 一致性高達(dá) 87%，與內(nèi)華達(dá)古白蟻（KDR09853.1，61%），膜翅蜜蜂（KOX80344.1，59%）等也有很高的一致性(圖 2-6)。PmATG12 與家蠶（NP_001135963.1，71%）有較高的一致性，和樺尺蛾(ADO32996.1，65%)，斑胸草雀（ACH43616.1，60%）均有很高同源性（圖 2-6）。

di斑節(jié)對蝦與其他物種ATGS氛基酸多重比對，相關(guān)物種名稱和注冊號見圖2-5.Fig.2-6Multiplealignmentsofthededuceda
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2892206