鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25編碼蛋白的免疫原性及其與細(xì)胞相互作用受體蛋白的篩選
發(fā)布時間：2020-12-03 16:43
鯽造血器官壞死癥,又名鯽皰疹病毒病,是一種由鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）引起的高度傳染性水生動物病毒性疾�。–yprinid herpesvirus 2,CyHV-2）。鯽造血器官壞死癥流行范圍廣,傳播速度快,致死率高,嚴(yán)重威脅鯽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前,圍繞該病致病機理與防治方法方面的研究越來越受到關(guān)注。本研究:1)比較了13株不同地區(qū)來源CyHV-2分離株的部分基因序列,包括ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55和ORF72;2)分析了CyHV-2 ORF25基因序列的抗原表位、疏水區(qū)及親水區(qū)位點,利用原核表達(dá)系統(tǒng)對CyHV-2 ORF25編碼蛋白富含抗原表位的區(qū)域進(jìn)行截短表達(dá),制備了抗CyHV-2 ORF25編碼蛋白的多克隆抗體,通過間接免疫熒光和免疫保護(hù)力測定等實驗研究了表達(dá)蛋白的免疫原性;3)利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了CyHV-2 ORF25截短基因編碼蛋白,并通過病毒復(fù)制抑制、膠體金免疫電鏡、血清中和試驗、免疫保護(hù)力測定等實驗研究了表達(dá)蛋白的免疫原性;4)采用酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩選出CyHV-2 ORF25編碼蛋白與異育銀鯽腦組織細(xì)胞（Gibel carp b...
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：128 頁
【學(xué)位級別】：博士
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表 （按字母順序排列）
第一章 文獻(xiàn)綜述
1.1 鯉皰疹病毒Ⅱ型研究進(jìn)展
1.1.1 流行病學(xué)
1.1.2 病原學(xué)
1.1.3 診斷與檢測方法
1.1.4 防治措施
1.2 病毒感染宿主細(xì)胞的分子機制
1.3 酵母雙雜交技術(shù)及其在水生動物病毒研究中的應(yīng)用
第二章 不同地區(qū)來源CyHV-2分離株部分基因序列比較分析
2.1 研究目的與意義
2.2 實驗材料
2.2.1 病料樣品
2.2.2 菌株與質(zhì)粒
2.2.3 主要試劑
2.2.4 主要耗材
2.2.5 主要實驗儀器設(shè)備
2.3 實驗方法
2.3.1 PCR引物設(shè)計
2.3.2 病毒DNA的提取
2.3.3 CyHV-2PCR檢測
2.3.4 CyHV-2部分基因片段擴增
2.3.5 目的片段連接T載體及測序
2.4 結(jié)果與分析
2.4.1 13株不同地區(qū)來源的CyHV-2鑒定
2.4.2 CyHV-2 ORF25基因序列分析
2.4.3 CyHV-2 ORF72基因序列分析
2.4.4 CyHV-2 ORF55部分基因序列分析
2.4.5 CyHV-2 ORF25B部分基因序列分析
2.4.6 CyHV-2 ORF25D部分基因序列分析
2.5 討論
第三章 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析
3.1 研究目的與意義
3.2 實驗材料
3.2.1 實驗魚及飼養(yǎng)條件
3.2.2 病毒與細(xì)胞系
3.2.3 菌株與質(zhì)粒
3.2.4 主要試劑
3.2.5 主要耗材
3.2.6 主要實驗儀器設(shè)備
3.3 實驗方法
3.3.1 CyHV-2在GiCB細(xì)胞中的增殖
3.3.2 CyHV-2病毒DNA的提取
3.3.3 CyHV-2 ORF25截短表達(dá)基因序列的選擇
3.3.4 PCR引物設(shè)計
3.3.5 PCR擴增目的基因
3.3.6 PCR產(chǎn)物的電泳檢測及純化
3.3.7 目的片段連接T載體及測序
3.3.8 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
3.3.9 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
3.3.10 重組蛋白的處理
3.3.11 重組蛋白的純化
3.3.12 多克隆抗體制備及效價測定
3.3.13 Westernblot分析
3.3.14 間接免疫熒光檢測
3.3.15 重組蛋白免疫保護(hù)率測定
3.3.16 數(shù)據(jù)分析
3.4 結(jié)果
3.4.1 CyHV-2 ORF25截短表達(dá)基因序列的選擇
3.4.2 CyHV-2 ORF25基因克隆
3.4.3 CyHV-2 ORF25基因T載體構(gòu)建
3.4.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
3.4.5 重組蛋白的表達(dá)與純化
3.4.6 重組蛋白多克隆抗體的制備及檢測
3.4.7 間接免疫熒光檢測
3.4.8 重組蛋白免疫保護(hù)率測定
3.5 討論
第四章 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25在畢赤酵母中的表達(dá)及其免疫原性研究
4.1 研究目的與意義
4.2 實驗材料
4.2.1 實驗魚及飼養(yǎng)條件
4.2.2 病毒與細(xì)胞系
4.2.3 菌株與質(zhì)粒
4.2.4 主要試劑
4.2.5 主要耗材
4.2.6 主要實驗儀器設(shè)備
4.3 實驗方法
4.3.1 CyHV-2 ORF25基因的擴增與純化
4.3.2 CyHV-2 ORF25基因連接T載體及測序
4.3.3 畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
4.3.4 重組質(zhì)粒的線性化和回收
4.3.5 電轉(zhuǎn)酵母菌
4.3.6 轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定
4.3.7 重組酵母的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)
4.3.8 表達(dá)產(chǎn)物的觀察與分析
4.3.9 純化產(chǎn)物的特性研究
4.3.10 免疫原的制備
4.3.11 注射免疫
4.3.12 樣品采集與處理
4.3.13 中和抗體效價檢測
4.3.14 免疫相關(guān)基因表達(dá)變化
4.3.15 攻毒實驗
4.3.16 數(shù)據(jù)分析
4.4 結(jié)果與分析
4.4.1 CyHV-2 ORF25基因克隆與重組質(zhì)粒構(gòu)建
4.4.2 表達(dá)產(chǎn)物純化
4.4.3 SDS-PAGE和Western blotting檢測表達(dá)產(chǎn)物
4.4.4 免疫電鏡觀察結(jié)果
4.4.5 病毒滴度抑制實驗
4.4.6 血清中和抗體效價
4.4.7 免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化
4.4.8 相對免疫保護(hù)率
4.5 討論
第五章 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25編碼蛋白宿主細(xì)胞受體的初步篩選
5.1 研究目的與意義
5.2 實驗材料
5.2.1 病毒與細(xì)胞系
5.2.2 菌株與質(zhì)粒
5.2.3 主要試劑
5.2.4 主要耗材
5.2.5 主要實驗儀器設(shè)備
5.3 實驗方法
5.3.1 GiCB細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建
5.3.2 CyHV-2 ORF25編碼蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定
5.3.3 篩選與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的GiCB細(xì)胞受體
5.4 結(jié)果與分析
5.4.1 GiCB細(xì)胞總RNA的提取
5.4.2 文庫質(zhì)量鑒定
5.4.3 CyHV-2-ORF25片段的擴增結(jié)果
5.4.4 重組誘餌質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定
5.4.5 酵母菌株陽性克隆的鑒定
5.4.6 重組菌報告基因表達(dá)檢測結(jié)果
5.4.7 篩選與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的細(xì)胞受體
5.4.8 初步驗證與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的細(xì)胞受體
5.5 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
本文編號：2896425
【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：128 頁
【學(xué)位級別】：博士
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表 （按字母順序排列）
第一章 文獻(xiàn)綜述
1.1 鯉皰疹病毒Ⅱ型研究進(jìn)展
1.1.1 流行病學(xué)
1.1.2 病原學(xué)
1.1.3 診斷與檢測方法
1.1.4 防治措施
1.2 病毒感染宿主細(xì)胞的分子機制
1.3 酵母雙雜交技術(shù)及其在水生動物病毒研究中的應(yīng)用
第二章 不同地區(qū)來源CyHV-2分離株部分基因序列比較分析
2.1 研究目的與意義
2.2 實驗材料
2.2.1 病料樣品
2.2.2 菌株與質(zhì)粒
2.2.3 主要試劑
2.2.4 主要耗材
2.2.5 主要實驗儀器設(shè)備
2.3 實驗方法
2.3.1 PCR引物設(shè)計
2.3.2 病毒DNA的提取
2.3.3 CyHV-2PCR檢測
2.3.4 CyHV-2部分基因片段擴增
2.3.5 目的片段連接T載體及測序
2.4 結(jié)果與分析
2.4.1 13株不同地區(qū)來源的CyHV-2鑒定
2.4.2 CyHV-2 ORF25基因序列分析
2.4.3 CyHV-2 ORF72基因序列分析
2.4.4 CyHV-2 ORF55部分基因序列分析
2.4.5 CyHV-2 ORF25B部分基因序列分析
2.4.6 CyHV-2 ORF25D部分基因序列分析
2.5 討論
第三章 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析
3.1 研究目的與意義
3.2 實驗材料
3.2.1 實驗魚及飼養(yǎng)條件
3.2.2 病毒與細(xì)胞系
3.2.3 菌株與質(zhì)粒
3.2.4 主要試劑
3.2.5 主要耗材
3.2.6 主要實驗儀器設(shè)備
3.3 實驗方法
3.3.1 CyHV-2在GiCB細(xì)胞中的增殖
3.3.2 CyHV-2病毒DNA的提取
3.3.3 CyHV-2 ORF25截短表達(dá)基因序列的選擇
3.3.4 PCR引物設(shè)計
3.3.5 PCR擴增目的基因
3.3.6 PCR產(chǎn)物的電泳檢測及純化
3.3.7 目的片段連接T載體及測序
3.3.8 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
3.3.9 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
3.3.10 重組蛋白的處理
3.3.11 重組蛋白的純化
3.3.12 多克隆抗體制備及效價測定
3.3.13 Westernblot分析
3.3.14 間接免疫熒光檢測
3.3.15 重組蛋白免疫保護(hù)率測定
3.3.16 數(shù)據(jù)分析
3.4 結(jié)果
3.4.1 CyHV-2 ORF25截短表達(dá)基因序列的選擇
3.4.2 CyHV-2 ORF25基因克隆
3.4.3 CyHV-2 ORF25基因T載體構(gòu)建
3.4.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
3.4.5 重組蛋白的表達(dá)與純化
3.4.6 重組蛋白多克隆抗體的制備及檢測
3.4.7 間接免疫熒光檢測
3.4.8 重組蛋白免疫保護(hù)率測定
3.5 討論
第四章 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25在畢赤酵母中的表達(dá)及其免疫原性研究
4.1 研究目的與意義
4.2 實驗材料
4.2.1 實驗魚及飼養(yǎng)條件
4.2.2 病毒與細(xì)胞系
4.2.3 菌株與質(zhì)粒
4.2.4 主要試劑
4.2.5 主要耗材
4.2.6 主要實驗儀器設(shè)備
4.3 實驗方法
4.3.1 CyHV-2 ORF25基因的擴增與純化
4.3.2 CyHV-2 ORF25基因連接T載體及測序
4.3.3 畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
4.3.4 重組質(zhì)粒的線性化和回收
4.3.5 電轉(zhuǎn)酵母菌
4.3.6 轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定
4.3.7 重組酵母的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)
4.3.8 表達(dá)產(chǎn)物的觀察與分析
4.3.9 純化產(chǎn)物的特性研究
4.3.10 免疫原的制備
4.3.11 注射免疫
4.3.12 樣品采集與處理
4.3.13 中和抗體效價檢測
4.3.14 免疫相關(guān)基因表達(dá)變化
4.3.15 攻毒實驗
4.3.16 數(shù)據(jù)分析
4.4 結(jié)果與分析
4.4.1 CyHV-2 ORF25基因克隆與重組質(zhì)粒構(gòu)建
4.4.2 表達(dá)產(chǎn)物純化
4.4.3 SDS-PAGE和Western blotting檢測表達(dá)產(chǎn)物
4.4.4 免疫電鏡觀察結(jié)果
4.4.5 病毒滴度抑制實驗
4.4.6 血清中和抗體效價
4.4.7 免疫相關(guān)基因的表達(dá)變化
4.4.8 相對免疫保護(hù)率
4.5 討論
第五章 鯉皰疹病毒Ⅱ型ORF25編碼蛋白宿主細(xì)胞受體的初步篩選
5.1 研究目的與意義
5.2 實驗材料
5.2.1 病毒與細(xì)胞系
5.2.2 菌株與質(zhì)粒
5.2.3 主要試劑
5.2.4 主要耗材
5.2.5 主要實驗儀器設(shè)備
5.3 實驗方法
5.3.1 GiCB細(xì)胞酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建
5.3.2 CyHV-2 ORF25編碼蛋白酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定
5.3.3 篩選與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的GiCB細(xì)胞受體
5.4 結(jié)果與分析
5.4.1 GiCB細(xì)胞總RNA的提取
5.4.2 文庫質(zhì)量鑒定
5.4.3 CyHV-2-ORF25片段的擴增結(jié)果
5.4.4 重組誘餌質(zhì)粒雙酶切及PCR鑒定
5.4.5 酵母菌株陽性克隆的鑒定
5.4.6 重組菌報告基因表達(dá)檢測結(jié)果
5.4.7 篩選與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的細(xì)胞受體
5.4.8 初步驗證與CyHV-2 ORF25編碼蛋白互作的細(xì)胞受體
5.5 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
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