發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 11:36

　　 微生物天然產(chǎn)物因其結(jié)構(gòu)多樣,生物活性顯著,以及次級(jí)代謝產(chǎn)物重現(xiàn)性好,成為了藥物或藥物先導(dǎo)分子的重要源泉。本文充分利用實(shí)驗(yàn)室研究平臺(tái),旨在挖掘微生物中的活性化合物,主要是以一株胡可黑蛋巢菌和一株秦嶺苔蘚土壤鏈霉菌為研究對(duì)象,優(yōu)化其發(fā)酵條件,利用正反相色譜層析、葡聚糖凝膠層析、高速逆流色譜技術(shù)和高效液相色譜等多項(xiàng)技術(shù)對(duì)菌株發(fā)酵提取物進(jìn)行分離純化,并對(duì)黑蛋巢菌中分離得到的一對(duì)互變異構(gòu)體進(jìn)行了衍生化,綜合運(yùn)用1D/2D NMR、MS、IR和UV等波譜分析方法鑒定出了48個(gè)化合物,其中包含10個(gè)新天然產(chǎn)物和14個(gè)新衍生物;化合物絕對(duì)構(gòu)型的鑒定主要結(jié)合CD、ECD、X-ray單晶衍射及化學(xué)反應(yīng)等方法。同時(shí),對(duì)其中43個(gè)化合物進(jìn)行了多種生物活性評(píng)價(jià)及作用機(jī)制探討。最后,對(duì)特殊生境來(lái)源的鏈霉菌H2S5做了全基因組測(cè)序,從生物信息學(xué)角度分析了其代謝潛能,并初步探索了其遺傳操作體系。主要研究結(jié)果如下:1、基于表觀遺傳修飾策略,從真菌Cyathus hookeri CGMCC 5.1116中分離鑒定了23個(gè)化合物,包括6個(gè)新鳥巢烷型二萜,命名為cyahookerin A-F(3-1~3-6),其中化合物3-1和3-2為首例報(bào)道的含二氧戊環(huán)基團(tuán)的鳥巢烷型二萜,并利用X-ray單晶衍射、化學(xué)反應(yīng)以及CD計(jì)算方法確定了新化合物的絕對(duì)構(gòu)型。NGF誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞促神經(jīng)突起生長(zhǎng)活性結(jié)果顯示,化合物3-3在10μM時(shí)的分化率高達(dá)32.02%,約為NGF對(duì)照的2倍。H_2O_2誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞氧化損傷的抑制活性結(jié)果顯示,化合物3-15活性最高,IC_(50)值為7.81μM。LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥抑制活性顯示,化合物3-9具有明顯的抗神經(jīng)炎活性,IC_(50)值為6.9μM。SAR分析可知,C-12位引入醛基或縮醛基團(tuán)、C-13位引入羥基以及C-12和C-13之間的α,β-不飽和醛基團(tuán)均有利于抗炎活性的提高。通過(guò)與iNOS的分子對(duì)接模擬初步探討了這類化合物的抗炎活性機(jī)制。以上幾種活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明,該類鳥巢烷型二萜可作為開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病的先導(dǎo)藥物,尤其是化合物3-3。2、基于多樣性導(dǎo)向合成策略,將一對(duì)互變異構(gòu)的鳥巢烷型二萜3-16衍生化,純化鑒定了14個(gè)新的衍生物。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性和抗神經(jīng)炎活性結(jié)果均顯示,化合物3-16的活性高于供試的12個(gè)衍生物,且3-16在10μM時(shí)NGF誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞分化率高達(dá)23.65%,約為NGF對(duì)照的1.5倍,與作用濃度呈現(xiàn)正相關(guān)的量效關(guān)系。神經(jīng)保護(hù)活性結(jié)果表明,衍生物4-3a、4-3b、4-4a、4-4b、4-6a、4-6b的IC_(50)值在13.96-33.56μM之間,均優(yōu)于母體化合物3-16。3、綜合HPLC分析以及活性向?qū)?從80株秦嶺放線菌中篩選出了一株可可鏈霉菌H2S5作為目標(biāo)菌株,從其培養(yǎng)物中共分離鑒定出了11個(gè)三烯霉素,含4個(gè)新化合物,命名為trienomycin J-M(5-1~5-3,5-11)。其中5-11為第二例含葡萄糖基團(tuán)的三烯霉素類化合物,并通過(guò)化學(xué)反應(yīng)方法確定了新化合物的絕對(duì)構(gòu)型。對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3和肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒活性結(jié)果顯示,除化合物5-11外,其余10個(gè)三烯霉素均有明顯的細(xì)胞毒活性,化合物5-4和5-7對(duì)兩株細(xì)胞的細(xì)胞毒活性均高于陽(yáng)性對(duì)照阿霉素,且IC_(50)值均小于0.7μM�；�合物5-1對(duì)HepG2的細(xì)胞毒活性最高,IC_(50)值為0.1μM;Hoechst染色、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明5-1是通過(guò)將細(xì)胞滯留在細(xì)胞周期的S期來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。除化合物5-11外,化合物5-1~5-10均表現(xiàn)出非常顯著的抗神經(jīng)炎活性,其中有8個(gè)化合物的活性明顯高于陽(yáng)性對(duì)照槲皮素�；�合物5-1,5-4和5-7的IC_(50)值分別為0.09μM,0.02μM和0.03μM。SAR分析可知,C-13位的羥基以及C-11位丙氨酸殘基所連的羧酸鏈均有助于抗神經(jīng)炎癥活性提高。與iNOS的分子對(duì)接模擬結(jié)果,從理論上揭示出這類化合物是通過(guò)其骨架上的苯酚基團(tuán)與iNOS活性位點(diǎn)中的Trp463上的芳香環(huán)相連進(jìn)而發(fā)揮抗神經(jīng)炎活性。4、對(duì)秦嶺鏈霉菌H2S5進(jìn)行了全基因組測(cè)序,分析結(jié)果顯示,其基因組為10.04Mb,GC含量為71.0%,含31個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇,涉及I型、II型、III型PKS、NRPS和PKS-NRPS等多種類型,展示出了巨大的代謝潛能。經(jīng)與已報(bào)道的mycotrienin基因簇(myc)的基因功能比對(duì)分析,確定tym基因簇為三烯霉素類化合物的生物合成基因簇。5、利用LC-MS對(duì)鏈霉菌H2S5代謝粗提物中的多個(gè)組分進(jìn)行了定性標(biāo)定;通過(guò)繪制trienomycin A的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出了野生型H2S5菌株中trienomycin A的理論產(chǎn)量為5.7 mg/L。測(cè)試了菌株H2S5的抗生素敏感性,確定了生孢培養(yǎng)基,從多方面嘗試了大腸桿菌與H2S5之間的接合轉(zhuǎn)移條件;同時(shí)針對(duì)tym基因簇中的調(diào)控基因、骨架合成基因PKS以及負(fù)責(zé)前體合成的基因構(gòu)建了5個(gè)遺傳改造用載體�？偠�言之,本研究通過(guò)研究一株真菌和一株特殊生境鏈霉菌的化學(xué)成分及其生物活性,挖掘出了極具開發(fā)前景的治療神經(jīng)退行性疾病以及前列腺癌與肝癌的藥物先導(dǎo)分子,并為這株鏈霉菌的生物合成研究奠定了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ460.1
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要符號(hào)對(duì)照表
附件
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 微生物天然產(chǎn)物研究策略
        1.1.1 單菌株多次級(jí)代謝產(chǎn)物策略
        1.1.2 特殊生境來(lái)源微生物資源的挖掘
        1.1.3 基因組挖掘
        1.1.4 合成生物學(xué)
    1.2 鳥巢烷型二萜研究進(jìn)展
        1.2.1 鳥巢烷型二萜結(jié)構(gòu)多樣性
        1.2.2 鳥巢烷型二萜的生物活性及構(gòu)效關(guān)系
    1.3 安莎霉素研究進(jìn)展
        1.3.1 安莎霉素種類及生物活性
        1.3.2 安莎霉素的生物合成研究概述
    1.4 論文設(shè)計(jì)思路
        1.4.1 選題背景
        1.4.2 選題目的及意義
第二章 活性向?qū)�下的�?shí)驗(yàn)菌株篩選
    2.1 研究背景
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 生物材料
        2.2.2 培養(yǎng)基
        2.2.3 試劑及儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 實(shí)驗(yàn)菌株小試發(fā)酵
        2.3.2 實(shí)驗(yàn)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物分析
        2.3.3 實(shí)驗(yàn)菌株粗提物生物活性測(cè)試
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 80株秦嶺放線菌代謝產(chǎn)物分析
        2.4.2 實(shí)驗(yàn)菌株粗提物生物活性測(cè)試結(jié)果
    2.5 小結(jié)
第三章 胡克黑蛋巢菌CGMCC5.1116 化學(xué)成分及其生物活性研究
    3.1 研究背景
        3.1.1 蛋巢菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究現(xiàn)狀
        3.1.2 化學(xué)表觀遺傳修飾策略
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1 菌株
        3.2.2 培養(yǎng)基
        3.2.3 主要試劑及試劑盒
        3.2.4 主要儀器、色譜耗材及生物材料
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 目標(biāo)菌株發(fā)酵條件篩選
        3.3.2 目標(biāo)菌株放大培養(yǎng)
        3.3.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物提取分離
        3.3.4 化合物3-16 的乳酸酯化
        3.3.5 化合物3-5 的水解反應(yīng)
        3.3.6 生物活性測(cè)試
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 菌株培養(yǎng)條件篩選的結(jié)果分析
        3.4.2 分離所得化合物的結(jié)構(gòu)解析
        3.4.3 生物活性測(cè)試結(jié)果
    3.5 小結(jié)
第四章 胡克黑蛋巢菌CGMCC5.1116 化學(xué)成分衍生化及其生物活性研究
    4.1 研究背景
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.2 試劑與溶劑
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 衍生路線
        4.3.2 生物活性測(cè)試
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 衍生物結(jié)構(gòu)表征
        4.4.2 衍生物生物活性評(píng)價(jià)結(jié)果
    4.5 小結(jié)
第五章 可可鏈霉菌阿蘇亞種H2S5 化學(xué)成分及其生物活性研究
    5.1 研究背景
    5.2 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.1 菌株
        5.2.2 培養(yǎng)基
        5.2.3 主要試劑及試劑盒
        5.2.4 主要儀器、色譜耗材及生物材料
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 目標(biāo)菌株發(fā)酵條件篩選
        5.3.2 目標(biāo)菌株放大培養(yǎng)
        5.3.3 次級(jí)代謝產(chǎn)物提取分離
        5.3.4 化合物5-4 的絕對(duì)構(gòu)型測(cè)定
        5.3.5 化合物5-11 的水解和糖構(gòu)型測(cè)定
        5.3.6 生物活性測(cè)試
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 菌株培養(yǎng)條件篩選的結(jié)果分析
        5.4.2 分離所得化合物的結(jié)構(gòu)解析
        5.4.4 生物活性測(cè)試結(jié)果
    5.5 小結(jié)
第六章 可可鏈霉菌阿蘇亞種H2S5 基因組測(cè)序及其次級(jí)代謝潛能分析
    6.1 研究背景
    6.2 實(shí)驗(yàn)材料
        6.2.1 菌株
        6.2.2 培養(yǎng)基
        6.2.3 試劑及儀器
    6.3 實(shí)驗(yàn)方法
        6.3.1 總基因組的提取
        6.3.2 基因組測(cè)序、組裝、序列分析
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 可可鏈霉菌H2S5 基因組測(cè)序與分析
        6.4.2 tym與其它三烯霉素生物合成基因簇的對(duì)比分析
    6.5 小結(jié)
第七章 可可鏈霉菌阿蘇亞種H2S5 菌株的遺傳改造
    7.1 研究背景
    7.2 實(shí)驗(yàn)材料
        7.2.1 菌株、質(zhì)粒與引物
        7.2.2 培養(yǎng)基
        7.2.3 試劑
        7.2.4 儀器
    7.3 實(shí)驗(yàn)方法
        7.3.1 可可鏈霉菌H2S5 粗產(chǎn)物中各化合物的標(biāo)定
        7.3.2 化合物5-4 的產(chǎn)量測(cè)定
        7.3.3 分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作
    7.4 結(jié)果與討論
        7.4.1 可可鏈霉菌H2S5 粗產(chǎn)物中各化合物的標(biāo)定結(jié)果
        7.4.2 可可鏈霉菌H2S5 生產(chǎn)化合物5-4 的產(chǎn)量
        7.4.3 可可鏈霉菌H2S5 的抗生素敏感性
        7.4.4 可可鏈霉菌H2S5 產(chǎn)孢培養(yǎng)基的選擇
        7.4.5 可可鏈霉菌H2S5 菌株與大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)方法和條件摸索
        7.4.6 可可鏈霉菌H2S5 菌株遺傳操作設(shè)計(jì)
    7.5 小結(jié)
第八章 總結(jié)與展望
    8.1 工作總結(jié)
    8.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    8.3 工作展望
        8.3.1 關(guān)于鳥巢烷型二萜
        8.3.2 關(guān)于三烯霉素
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


本文編號(hào)：2846247