發(fā)布時間：2020-10-18 10:42

　　 蝦青素是自然界中一種具有較強抗氧化能力的類胡蘿卜素,其中的3S-3'S構(gòu)型生物學(xué)活性最高,在醫(yī)藥品、食品、飼料以及化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值。為了提高蝦青素的生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本,本文以釀酒酵母為操作平臺,以蛋白質(zhì)分子改造和動態(tài)代謝調(diào)控為手段,開展一系列合成生物學(xué)方面的應(yīng)用基礎(chǔ)研究,構(gòu)建產(chǎn)蝦青素的釀酒酵母細胞工廠,實現(xiàn)蝦青素的高效生物合成。首先,從雨生紅球藻中克隆了 β-胡蘿卜素酮化酶和β-胡蘿卜素羥化酶基因,并通過密碼子優(yōu)化提高了其表達量。將這兩個基因整合到產(chǎn)β-胡蘿卜素釀酒酵母工程菌中,成功合成了 3S-3'S構(gòu)型的蝦青素。在明確這兩個酶的底物選擇性后,進一步對這兩個酶進行了拷貝數(shù)的精細調(diào)控,最終通過整合各兩個或三個拷貝的OBKT和OCrtZ,獲得YPP9和YPP13菌株,蝦青素含量分別達到3.54 mg/g DCW和 4.20 mg/g DCW。為了進一步提高蝦青素產(chǎn)量,代謝前體物的充足供應(yīng)和高效轉(zhuǎn)化是必要條件。為此,首先用紅發(fā)夫酵母牻牛兒基牛兒基焦磷酸(GGPP)合酶的陽性突變體CrtE03M替換出發(fā)菌株YPP0中的野生型CrtE,構(gòu)建的Ycarot-02菌株中前體物質(zhì)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高56%,達到了 16.37mg/gDCW。其次,通過類胡蘿卜素之間的顏色差異,建立了 OBKT的定向進化策略,獲得了一株OBKTM陽性突變體,促進了 β-胡蘿卜素向下游產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化,與表達野生型OBKT的對照菌株相比,β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化率提高了 50%,同時角黃素的產(chǎn)量提高了 1.4倍。結(jié)合OBKTM、CrtE03M和途徑中其它關(guān)鍵酶基因的過表達,以及輔因子Fe2+的添加,使構(gòu)建的雙倍體菌株YastD-03的蝦青素含量達到8.10 mg/g DCW(47.18 mg/L)。在此過程中發(fā)現(xiàn),OCrtZ的酶活也是制約蝦青素產(chǎn)量的一個關(guān)鍵因素,因此進一步對OCrtZ和OBKTM進行了共定向進化,獲得了 OCrtZM1和OBKTM29突變體,在Ycarot-02菌株中同時表達這兩個陽性突變體后,構(gòu)建的YPP-27菌株蝦青素含量達到了 5.70 mg/gDCW,相比于OCrtZ和ObktM組合表達時提高了 38.7%。雖然YPP-27產(chǎn)量低于之前構(gòu)建的雙倍體YastD-03,但由于代謝壓力相對較小,菌株的遺傳穩(wěn)定性更好。在對構(gòu)建的產(chǎn)蝦青素釀酒酵母菌株進行發(fā)酵研究的過程中,發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素過早積累會對細胞生長造成不利影響,最終影響高密度發(fā)酵。為了解決人工合成途徑和底盤細胞之間的相互干擾,在接下來的研究中基于GAL調(diào)控系統(tǒng),開發(fā)了一套溫度響應(yīng)的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng),使細胞生長和產(chǎn)物積累分成兩個階段進行。在敲除GAL80基因的基礎(chǔ)上,GAL啟動子的活性只受轉(zhuǎn)錄激活因子Ga14的控制。基于以上原理,首先利用番茄紅素作為指示來建立高通量篩選方法,篩選出了一株溫度敏感并且在目標溫度保留較高調(diào)控活性的突變體Gal4M9,通過溫度優(yōu)化發(fā)現(xiàn)在24℃時,Ga14M9的活性最佳。然后,利用報告基因EGFP的表達情況以及番茄紅素合成途徑中基因的轉(zhuǎn)錄水平,對基于Ga14M9構(gòu)建的溫敏型調(diào)控系統(tǒng)進行了表征,確認了其溫度響應(yīng)特性。隨后,利用番茄紅素作為試驗產(chǎn)品,構(gòu)建了溫度調(diào)控的Ylyc-TS03(+)菌株,在高密度發(fā)酵實驗中,成功實現(xiàn)了細胞生長和產(chǎn)物合成階段的分離,并且番茄紅素產(chǎn)量達到了 1.14g/L。最后,將該溫敏調(diào)控系統(tǒng)進一步應(yīng)用到了蝦青素的生物合成中,構(gòu)建了溫敏型菌株Yast-TS9,在搖瓶發(fā)酵中表現(xiàn)出明顯的溫度響應(yīng),溫度從30℃切換至24℃后蝦青素產(chǎn)量提高了 28倍,含量為4mg/gDCW。在補料發(fā)酵中,OD600達到了 250左右,實現(xiàn)了高密度發(fā)酵,類胡蘿卜素的積累也呈現(xiàn)了嚴謹?shù)臏囟日{(diào)控模式,最后總類胡蘿卜產(chǎn)量達到 505 mg/L。本研究結(jié)合基因挖掘、表達優(yōu)化、蛋白質(zhì)工程、動態(tài)代謝調(diào)控等手段,成功構(gòu)建了產(chǎn)蝦青素釀酒酵母工程菌株。這項工作有效地將理論研究和應(yīng)用研究進行結(jié)合,將為蝦青素的生物合成提供技術(shù)支持,同時研究過程中開發(fā)的蛋白質(zhì)改造和代謝調(diào)控策略將為利用釀酒酵母合成其他高附加值化合物提供方法借鑒。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ929
【部分圖文】：

１．１．３．１蝦青素的生理功能??與Ｐ－胡蘿卜素、番茄紅素等分子不同，蝦青素除了含有疏水性的主碳鏈外，??兩端還含有親水性的羥基和酮基，使其可以橫跨細胞膜（如圖１．２）?［６］，通過血??腦屏障，因此與位于磷脂雙分子層內(nèi)部的Ｐ－胡蘿卜素、番茄紅素等相比能更好抵??抗脂質(zhì)過氧化。由于蝦青素具有很強的抗氧化能力，不僅可以有效地清除細胞內(nèi)??外的氧自由基，減少衰老細胞的堆積，也可以預(yù)防心血管疾病、癌癥類疾病以及??一些免疫系統(tǒng)上的疾�。郏罚�，在保護機體、維持機體平衡方面具有重要的意義。??ＶＩＴＡＭＩＮ?Ｃ??Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?Ｆｌｕｉｄ?（Ｓｙｃｏｐｒｏｉｅｒ?ｐ＇＂?Ｍｔｔｒｔｘａｎｅ??（ＣｅＨ?ｅｘｔｅｒｉｏｒ）?／?Ｊ？．?嚴伽??ｔ?＾?＾?／??■＊〇（＞＜？?／?Ｇｔｙｃ〇Ｗ）？Ｊ??３Ｓ．３Ｓ＇ＡＳＴＡＸＡＮＴＨＩＮ?｜｝．ｐ－ＣＡＲＯＴＥＮＥ?Ｊ??“?Ｍｅｍｂｒａｎｅ?．???—Ｎｕｃｌｅｕｓ??＆?ＣｅＮ?：??圖１．２類胡蘿卜色的細胞膜儲存模型［６］??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｓｔｏｒａｇｅ?ｏｆ?ｃａｒｏｔｅｎｉｏｄｓ?ｉｎ?ｃｅｌｌ?ｍｅｍｂｒａｎｅ??２

衍生合成的。首先乙酰輔酶－Ａ?（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）經(jīng)過曱羥戊酸途徑（ＭＶＡ途徑）??或者丙酮酸鹽和３－磷酸甘油醛經(jīng)過２－曱基－Ｄ－赤蘚糖醇－４－磷酸途徑（ＭＥＰ途徑）??合成ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ［１１，３Ｇ］（如圖１．３所示），其中ＭＶＡ途徑主要存在于酵母等真??核細胞中，而ＭＥＰ途徑存在于大部分的細菌和植物的質(zhì)體中［３１，３２］。??ＭＶＡ?ｐａｔｂ、ｖａ＾￣ｌ?ＭＥＰ?ｐａｔｈｗａｙ??Ａｃ？ｔ＞ｌ－ＣｏＡ?Ｐｊｔｕｖ＊ｔｉｒＫ；�。�ｃｅｒ８ｌｄｃｈｙｄｅ＞３－ｐｈｏｓｐｈａｔｃ??Ｉ?——?ＤＸ—?ｊ?ｄｘｓ??Ａｃｃｔｏａｃｅｆｊｌ－ＣｏＡ?ＣＡＡＣｏＡ）?ｌ－Ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｘｊ?ｌｕＩｏｓｃ－Ｓ－ｐｈｏｓｐｈａｔｃ?（．?ＤＸＰ）??｜ＨＭＧ－ＣｏＡｓｖ＊ｎｔ｝？ａｓｃ?ＤＸＰ?ｒｃｄｕｃｕ．＾?Ｉ?＾??３－ｈｙｄｒ〇Ｘｙ－３－ｎｉｃｔｈ．ｖＩ－ｇｌｕｔａｒ＞�。�ＣｏＡ?（ＨＭＧ－Ｃ?ｏＡ）?２－Ｃ：－ｍｃｔｈ＞１－Ｄ－ｃｍｌｉｒｉｒ〇�。�４－ｐｂ〇ＳｐｈａＵ（ＭＥＰ）??｜?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ?｛ｔＨＭＧ?ｌ）?ＣＤＰ－ＭＨ?Ｔｒａｎｓｔｅｒａｓｅ?｜??Ｍｅ％ａｌｏｎｕｔｃ?＾ｒＤｒ－ＭＮｎｕｔｈｙｌ－Ｄ－ｉｒｊＩｈｒｆｔｏｌ?（ＣＤＩ＾ＭＫ）??｜?Ｍｃ＼！ａｌｏｉｗ�。�?ｋｉｎａｓｅ?ＣＤＰ－ＫｆＥ?ｋｉｎａｓｅ?Ｉ?ｉｓｊｔＥ??Ｍｃ＾？ｉｏｎ？ｔｃ－５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ??Ｉｐｈｏ．ｐｈｏｒａｅｖａｋｍａｔｃｋ

的３和３’碳位各加一個羥基和４和４’碳位各加一個酮基，在大部分產(chǎn)蝦青素的??生物體中，該過程需要兩個酶Ｐ－胡蘿卜素羥化酶（ＣｒｔＺ）和（３－胡蘿卜素酮化酶??（ＣｒｔＷ或者ＢＢＣＴ）催化（如圖１＿４所示）。??ＩＰＰ?ＤＭＡＰＰ??］ＥＲＧ２０??人八＾￣—￣＊ＳＱｕａＩｅｎｅ－???Ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ??Ｃｒｔｆｃ：?（Ｘ．ｄ．）｜?ＲＴＳＩ?（Ｓ．ｃ．）??纖＊：?以??｜?ＣｒｔＹＢ??Ｐｈｙｔｏｅｎｅ??Ｉ?ｃｍ??Ｌｙｃｏｐｅｕｅ??Ｖ?Ｅｄｊｉｎｅｎｏｎｅ?〇；ｊ＾＾ｐ－ｃｒｙｐ（ｏｘａｎｔｈｉｎ??＂＂Ｖ＇＇?３－ｈｙｄｒｏｘ》ｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ??ｕ?ＣａｎｔｈａｘｆｌｉｉＵｉｉｎ?Ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ??ＣｒｌＺ＼?Ｙ＾Ｓ＇－ｈｖｄｒｏｘｖｅｃｈｉｎｅｎｏｎｅ?／（ｎ＇ｖ??＼?ｗ??一丫?Ａｓｉａ＾ｎ＾??圖１．４蝦責(zé)素的生物合成途徑??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??７??
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本文編號：2846196