發(fā)布時(shí)間：2020-10-20 15:06

　　 β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)能通過(guò)催化β-1,4-甘露糖苷鍵,將甘露聚糖水解為甘露糖和甘露低聚糖。作為一種重要的工業(yè)用酶制劑,β-甘露聚糖酶被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料、食品加工、生物漂白、紡織、可再生能源等領(lǐng)域。由于一些應(yīng)用領(lǐng)域在加工過(guò)程中需要進(jìn)行高溫處理,如飼料制粒、可再生能源生產(chǎn)等,這就要求所開(kāi)發(fā)的β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能。目前,市面上存在的β-甘露聚糖酶在耐高溫性能方面往往達(dá)不到要求,因此,開(kāi)發(fā)一種具有優(yōu)良耐高溫能力的β-甘露聚糖酶就顯得非常迫切,具有良好的應(yīng)用前景。在本研究中,我們從熱泉中(水溫高于68℃)分離、篩選出一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的嗜熱枯草芽孢桿菌(TBS2)。以TBS2為出發(fā)菌株,經(jīng)過(guò)基因克隆,在畢赤酵母X33中進(jìn)行表達(dá),獲得了一種重組耐高溫β-甘露聚糖酶(ReTMan26)。采用純化后的ReTMan26,完成了該酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)并對(duì)其耐高溫機(jī)理進(jìn)行了相應(yīng)分析。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)密碼子優(yōu)化,大幅提高了ReTMan26在畢赤酵母中的表達(dá)水平。此外,還確定了來(lái)源于生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物粗甘油可以作為一種廉價(jià)碳源,用于畢赤酵母進(jìn)行ReTMan26的發(fā)酵生產(chǎn)。主要研究結(jié)果如下:(1)從熱泉中分離、篩選出一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的細(xì)菌,通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化培養(yǎng)特征、16S rDNA序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),鑒定出該細(xì)菌為一種嗜熱枯草芽孢桿菌(TBS2)。該菌可在pH 4.0-9.0、35-80℃條件下生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)pH為6.0-7.0、最適生長(zhǎng)溫度為50℃。TBS2所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶(BS-Man)的最適反應(yīng)pH為6.0,最適反應(yīng)溫度為55℃,在90℃、水溶液狀態(tài)下處理10 min,剩余酶活達(dá)到63.6%。(2)通過(guò)從NCBI中查找出其它來(lái)源于枯草芽孢桿菌的β-甘露聚糖酶保守序列,設(shè)計(jì)引物,成功克隆出來(lái)源于嗜熱枯草芽孢桿菌TBS2中的耐高溫β-甘露聚糖酶基因TBS2-Man。TBS2-Man基因序列長(zhǎng)957 bp,編碼318個(gè)氨基酸。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)及基因序列分析,該β-甘露聚糖酶屬于第26糖苷水解酶家族,含有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(N8、N26與N255)及2個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)(C48、C68)。在此基礎(chǔ)上,采用克隆出的基因TBS2-Man,構(gòu)建并篩選出了一株產(chǎn)重組耐高溫β-甘露聚糖酶(ReTMan26)的畢赤酵母工程菌Orig-pPICZαA-X33,該菌株在搖瓶中的發(fā)酵水平為312 U×mL~(-1),在50 L罐中通過(guò)高密度液體發(fā)酵的表達(dá)水平為5435 U×m L~(-1)。(3)對(duì)重組畢赤酵母Orig-pPICZαA-X33表達(dá)的ReTMan26純化后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè),結(jié)果表明:該酶的最適pH為6.0,在pH 2.0-8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定;最適反應(yīng)溫度為60℃,有效作用溫度范圍為20-100℃,且在100℃、水溶液條件下處理10 min后,剩余酶活仍然可以達(dá)到58.6%;10 mmol×L~(-1)的Mg~(2+)、Mn~(2+)對(duì)ReTMan26活性具有促進(jìn)作用,而Ag~+、Hg~(2+)及SDS對(duì)ReTMan26具有較強(qiáng)的抑制作用;ReTMan26的V_(max)為1612 U×mg~(-1)蛋白,K_m值為4.35 mg×mL~(-1)。此外,ReTMan26表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶)的消化能力。以上酶學(xué)性質(zhì)表明,除其它潛在工業(yè)應(yīng)用外,ReTMan26適宜作為一種飼料酶進(jìn)行應(yīng)用。(4)為探究ReTMan26的耐高溫機(jī)理,對(duì)該酶進(jìn)行了氨基酸序列比對(duì)及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明:更短的氨基酸序列、部分氨基酸位點(diǎn)不同、二硫鍵及N-糖基化可能是造成ReTMan26具有優(yōu)良耐高溫性能的根本原因。為進(jìn)一步確定N-糖基化及二硫鍵對(duì)ReTMan26的穩(wěn)定性,尤其是耐高溫性能的影響,分別采用天然蛋白去糖基化試劑盒及定點(diǎn)突變的方法,去除了ReTMan26中的N-多糖鏈及2個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)(C48、C68)。研究發(fā)現(xiàn),N-糖基化可提高ReTMan26的最適反應(yīng)溫度、耐熱性能分別為5℃和7℃。此外,N-糖基化還可提高ReTMan26抗胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化性能分別為23.7%及25.6%。二硫鍵對(duì)ReTMan26的最適反應(yīng)溫度及提高抗消化酶性能沒(méi)有影響,但可提高耐熱性能約3℃。(5)為進(jìn)一步提高ReTMan26在畢赤酵母X33中的表達(dá)水平,對(duì)來(lái)自于TBS2中的原始ReTMan26編碼基因TBS2-Man(Orig)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,并構(gòu)建出了一株含優(yōu)化基因(CoOp)的新重組畢赤酵母CoOp-p PICZαA-X33生產(chǎn)菌株。該菌株在高密度液體發(fā)酵中,ReTMan26的表達(dá)水平為10750 U×m L~(-1),在相同條件下,其生產(chǎn)性能比原重組畢赤酵母Orig-pPICZαA-X33(5412 U×mL~(-1))提高了98.6%。另外,在經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因(CoOp)基礎(chǔ)上,繼續(xù)對(duì)該基因上游的信號(hào)肽(α-factor)進(jìn)行了Kozak序列(GCCACCATG)改造,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法對(duì)提高ReTMan26在畢赤酵母中的表達(dá)水平?jīng)]有效果,但這對(duì)今后構(gòu)建畢赤酵母重組工程菌表達(dá)系統(tǒng),具有一定的參考作用。(6)為降低ReTMan26的生產(chǎn)成本,充分利用廢棄資源,采用來(lái)源于生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物粗甘油作為畢赤酵母快速生長(zhǎng)期間的唯一碳源,結(jié)果表明:粗甘油中的皂類物質(zhì)在添加濃度低于0.3%(相對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比)時(shí),不會(huì)抑制高密度液體發(fā)酵時(shí)的畢赤酵母菌體生長(zhǎng)及ReTMan26生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上,不經(jīng)任何前處理的粗甘油,可替代純甘油用于ReTMan26的發(fā)酵生產(chǎn)。通過(guò)采用粗甘油替代純甘油,ReTMan26的全部發(fā)酵生產(chǎn)成本可降低約4.2%。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ926
【部分圖文】：

[19]。β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖的示意圖如圖1-2所示：圖1-2 β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖示意圖Fig. 1-2 The schematic diagram of mannan hydrolysis by β-mannanase1.2 國(guó)內(nèi)外研究、應(yīng)用進(jìn)展1.2.1 β-甘露聚糖酶的國(guó)內(nèi)外研究、應(yīng)用進(jìn)展人們對(duì)β-甘露聚糖酶的研究、應(yīng)用開(kāi)發(fā)可以追溯到二十世紀(jì)五十年代。Courtios等人于1958年首次從紫花苜蓿(Alfalfa)中發(fā)現(xiàn)一種β-甘露聚糖酶[20]， Williams 和Doetsch于1960年報(bào)道從瘤胃厭氧鏈球菌(anaerobic rumen Streptococci)中獲得一種β-甘露聚糖酶[21]， 隨后，Reese和Shibata等人于1965年第一次系統(tǒng)性地提出了β-甘露聚糖酶的概念[22]。國(guó)內(nèi)外目前對(duì)β-甘露聚糖酶的研究主要包括β-甘露聚糖酶的來(lái)源與理化性質(zhì)、β-甘露聚糖酶的蛋白結(jié)構(gòu)分析、β-甘露聚糖酶的發(fā)酵與分離純化、β-甘露聚糖酶的基因克隆與表達(dá)，以及β-甘露聚糖酶的應(yīng)用開(kāi)發(fā)等方面。1.2.1.1 β-甘露聚糖酶的來(lái)源及理化性質(zhì)β-甘露聚糖酶廣泛存在于植物、動(dòng)物及微生物中，例如，在一些低等動(dòng)物的腸道分泌液[23-25]以及一些植物的發(fā)芽種子中[26, 27]，都發(fā)現(xiàn)有β-甘露聚糖酶的存在。

露聚糖酶在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)方面會(huì)存在一定的差異，尤其是GH5、GH26及GH113這3個(gè)家族與GH134家族相差較大。圖1-3為分別屬于四種不同糖苷水解酶家族的β-甘露聚糖酶蛋白三維結(jié)構(gòu)模型圖。圖1-3 屬于不同類型糖苷水解家族的典型β-甘露聚糖酶蛋白三維結(jié)構(gòu)圖A：屬于GH5家族、來(lái)源于子囊菌(Chrysonilia Sitophila)的β-甘露聚糖酶CsMan5 (PDB ID號(hào)：4AWE)；B：屬于GH26家族、來(lái)源于纖維弧菌(Cellvibrio japonicas)的β-甘露聚糖酶CjMan26C (PDBID號(hào)：4CD4)；C：屬于GH113家族、來(lái)源于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的β-甘露聚糖酶AaManA (PDB ID號(hào)：4CD6)；D：屬于GH134家族、來(lái)源于鏈霉菌屬NRRL B-24484(Streptomyces sp. NRRL B-24484)的β-甘露聚糖酶SsGH134 (PDB ID號(hào)：5JU9)。Fig. 1-3 Three-dimensional structures of typical β-mananases belonging todifferent glycoside hydrolase familiesA: GH5 -mannanase CsMan5 from Chrysonilia Sitophila (PDB ID: 4AWE); B: GH26 -mannanaseCjMan26C from Cellvibrio japonicas (PDB ID: 4CD4); C: GH113 -mannanase AaManA fromAlicyclobacillus acidocaldarius (PDB ID: 4CD6); D: GH134 -Mannanase SsGH134 from Streptomycessp. NRRL B-24484 (PDB ID: 5JU9).雖然各種β-甘露聚糖酶在氨基酸序列上會(huì)存在一定差異，但除GH134家族外，GH5、GH26及GH113的β-甘露聚糖酶的催化域都是由8個(gè)α-螺旋及8個(gè)β-折疊交替排列形成的TIM桶狀結(jié)構(gòu)，其中排列在一起的8個(gè)β-折疊片段形成桶狀內(nèi)部凹槽結(jié)構(gòu)，與之相連接的α-螺旋則組成桶的外沿。另外，在β-甘露聚糖酶的TIM桶狀結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中，由處于一級(jí)氨基酸序列上不同位置的8個(gè)保守氨基酸構(gòu)成該桶狀的活性口袋

有助于所表達(dá)的蛋白進(jìn)行檢測(cè)和純化。另外，pPICZαA質(zhì)粒上含有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子pAOX1，嚴(yán)格受甲醇的誘導(dǎo)和調(diào)控。pPICZαA的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-4。圖1-4 表達(dá)載體pPICZαA結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1-4 The physical map of pPICZαA vector1.2.2.1.2 啟動(dòng)子目前最常用的啟動(dòng)子為pAOX1，它可以對(duì)醇氧化酶基因AOX1進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，在甲醇存在時(shí)，可誘導(dǎo)該啟動(dòng)子下游的外源基因進(jìn)行表達(dá)。至今為止，已有許多外源蛋白通過(guò)該啟動(dòng)子獲得了表達(dá)，如來(lái)源于人類大腦組織的乙酰膽堿脂酶[144]、來(lái)源于釀酒酵母的超氧化物歧化酶(SOD)[145]以及來(lái)源于嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum)的耐熱木聚糖酶等[146]。另外，作為不利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子pGAP(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)被Waterham 等于1997 年開(kāi)發(fā)出來(lái)[147]。pGAP啟動(dòng)子可使畢赤酵母利用葡萄糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，在組成型質(zhì)粒pGAPZa (A,B, C)中即存在該啟動(dòng)子。據(jù)報(bào)道，已有部分外源蛋白通過(guò)pGAP啟動(dòng)子獲得了表達(dá)
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2848833