發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 18:15

　　 嬰兒出生時(shí)腸道發(fā)育尚未成熟,腸道免疫發(fā)育緩慢,這種腸道發(fā)育不成熟使得他們更容易感染各種病癥,如壞死性小腸結(jié)腸炎等。母乳含有多種生物活性成分,有助于嬰兒腸道正常生長(zhǎng)和發(fā)育,其中一種重要的組分是乳鐵蛋白。乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)在經(jīng)消化道酶水解作用下會(huì)釋放具有生物活性的肽段——乳鐵蛋白素(lactoferricin,Lfcin)。研究表明,乳鐵蛋白具有抵抗真菌和病菌感染、減緩炎癥反應(yīng)、抗癌及提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)的能力,尤其在促進(jìn)腸道免疫方面具有顯著作用�，F(xiàn)階段包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家均已將乳鐵蛋白作為嬰兒配方奶粉的重要添加組成分。近兩年,巴氏殺菌奶開始進(jìn)入我國(guó)消費(fèi)者視線,以其最大程度保持了鮮奶的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味及生物活性成分等特點(diǎn)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。探究不同熱處理?xiàng)l件對(duì)乳鐵蛋白免疫活性的影響,確立保持乳鐵蛋白生物活性的最佳巴氏殺菌參數(shù),并探討其有效提高嬰兒免疫力的劑量,為現(xiàn)代乳制品加工技術(shù)更科學(xué)和精準(zhǔn)的發(fā)展提供新證據(jù)。本研究以鮮牛乳來(lái)源的乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,bLF)為原料,通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探究乳鐵蛋白對(duì)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)在增殖、周期、凋亡和周期相關(guān)基因表達(dá)等方面的影響,以此確定在體外環(huán)境下,乳鐵蛋白的最佳熱處理?xiàng)l件及劑量范圍。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù),結(jié)合母乳常乳中乳鐵蛋白的含量,選定恰當(dāng)?shù)母咧械蛣┝?灌胃SD雄性大鼠,通過(guò)血液免疫和腸道免疫各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)估,探究最佳熱處理?xiàng)l件對(duì)乳鐵蛋白免疫活性的影響。確定適當(dāng)?shù)募庸すに嚰疤砑臃秶�。�?shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,巴氏殺菌后牛乳鐵蛋白均可通過(guò)增加IEC-6細(xì)胞與周期相關(guān)基因cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表達(dá)水平,降低p21的表達(dá)水平,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布,增加IEC-6細(xì)胞在G_2/M期和S期的分布,降低細(xì)胞在G_0/G_1期的分布,促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖,減緩細(xì)胞凋亡。72℃/15s和85℃/15s均可最大化保留乳鐵蛋白的免疫活性,體外促進(jìn)嬰兒腸道免疫的最佳劑量為0.1 mg/mL。(2)在動(dòng)物灌胃實(shí)驗(yàn)中,兩種處理方式下(未經(jīng)熱處理和85℃/15s)的牛源乳鐵蛋白均對(duì)血液免疫和腸道免疫具有調(diào)節(jié)作用,可增強(qiáng)機(jī)體免疫。乳鐵蛋白可以增加大鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、IgM的分泌量,上調(diào)大鼠血清中IFN-γ/IL-4比值,維持Th1和Th2型細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)降低大鼠血清中DAO的活性,增加大鼠結(jié)腸中sIgA分泌量,增加大鼠結(jié)腸Occludin與ZO-1基因的表達(dá)量,乳鐵蛋白能夠降低大鼠腸粘膜通透性,提高大鼠腸道屏障功能和免疫功能;(3)綜合血液免疫和腸道免疫各項(xiàng)指標(biāo)表明,85℃/15s的熱處理方式對(duì)乳鐵蛋白的免疫活性基團(tuán)無(wú)顯著破壞作用,灌胃劑量60 mg/kg·BW免疫調(diào)節(jié)效果最佳。巴氏滅菌雖可部分損傷乳鐵蛋白的免疫活性基團(tuán),但不能使其生物活性降低。巴氏殺菌85℃/15s是保留生鮮乳中免疫蛋白免疫活性的最佳殺菌條件。(4)隨著灌胃時(shí)間的增加,調(diào)節(jié)作用更加顯著。表明乳鐵蛋白對(duì)于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。巴氏殺菌85℃/15s是保留生鮮乳中免疫蛋白免疫活性的最佳殺菌條件,這為現(xiàn)階段乳制品加工工藝參數(shù)設(shè)計(jì)以及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑添加量提供理論依據(jù),同時(shí)又引導(dǎo)了國(guó)內(nèi)本土生鮮奶產(chǎn)品的發(fā)展方向。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS252.1
【部分圖文】：

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文果與分析體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對(duì) IEC-6 細(xì)胞增殖的影響照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)母乳常乳中的乳鐵蛋白含量 1 g/L 為上限，實(shí)驗(yàn)初期濃度選 mg/mL 中幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)濃度，進(jìn)行嘗試。結(jié)果顯示細(xì)胞增殖濃度以 0.1 mg/mL 為分小于 0.1 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞增殖率逐漸增大，當(dāng)濃度大于 0.1 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞增趨勢(shì)。最終選定最佳濃度范圍為 0-0.1 mg/mL，選擇幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)濃度進(jìn)行試驗(yàn)圍下培養(yǎng) 24 和 48 h 細(xì)胞增殖率，24 h 細(xì)胞增殖情況結(jié)果如圖 3-1 所示。

*與相應(yīng)濃度下未熱處理乳鐵蛋白組比較，差異顯著（P＜0.05）圖 3-2 不同濃度乳鐵蛋白水解液刺激 IEC-6 細(xì)胞 48 h 細(xì)胞增殖情況Figure 3-2 Effects of lactoferrin hydrolyzate after pasteurization on proliferationof IEC-6 cells for 48 h圖 3-1 和 3-2 所示結(jié)果，4 種處理?xiàng)l件下的乳鐵蛋白，刺激 IEC-6 細(xì)胞 24 和 48大致相同。隨著乳鐵蛋白水解液濃度的升高，IEC-6 細(xì)胞增殖率逐漸升高，且在濃度為 0.1 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞的增殖率達(dá)到最大。當(dāng)濃度在 0.1 mg/mL 以上時(shí)降趨勢(shì)。同巴氏殺菌條件對(duì) IEC-6 細(xì)胞增殖影響方面，與未熱處理的牛源乳鐵蛋白水解 63℃/30min 外，其他 2 種加熱處理方式對(duì)乳鐵蛋白的免疫活性沒有顯著地5），尤其是 85°C/15s 的巴氏殺菌方式，細(xì)胞培養(yǎng) 48 h 后，基本與未熱處理的牛殖 IEC-6 細(xì)胞效果持平，在水解液濃度為 0.02 mg/mL 和 0.08 mg/mL 條件下，處理組。由此可知，巴氏殺菌并沒有使乳鐵蛋白的免疫活性基團(tuán)完全失活，4 的乳鐵蛋白水解液最佳增殖劑量均為 0.1 mg/mL。巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對(duì) IEC-6 細(xì)胞周期的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用最佳細(xì)胞增殖濃度 0.1 mg/mL 的 4 種處理方式下的乳鐵蛋白水

圖 3-3 不同巴殺條件下的乳鐵蛋白水解液刺激 IEC-6 細(xì)胞 24 h 周期圖例Figure 3-3 Cell cycle legends of lactoferrin hydrolysate under different pasteurizationconditions stimulated IEC-6 cell for 24 h驗(yàn)采用濃度為 0.1 mg/mL 的牛鮮乳來(lái)源乳鐵蛋白水解液作用 IEC-6 細(xì)胞 24 h 后行流式檢測(cè)。結(jié)果如表 3-1 所示。表 3-1 濃度為 0.1 mg/mL 的乳鐵蛋白水解液作用 24 h 對(duì) IEC-6 細(xì)胞周期的影響ble 3-1 Effects of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysate under different pasteurization oncycle of IEC-6 cells for 24 h處理?xiàng)l件 細(xì)胞周期（%）G0/G1G2/M+S空白組 85.84±3.52a14.16±3.53d未熱處理組 61.44±2.54d38.56±2.54a63℃/30min 71.28±1.57b28.72±1.56c72℃/15s 67.80±1.96bc32.20±1.97bc85℃/15s 63.80±1.80cd36.20±1.80ab小寫字母不同，表示各組差異顯著（P＜0.05）。
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本文編號(hào)：2891802