發(fā)布時(shí)間：2020-11-23 16:17

　　 抗生素在動(dòng)物源食品中的殘留會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,當(dāng)人體攝入含有抗生素殘留的食物,會(huì)造成抗生素的體內(nèi)積累,從而產(chǎn)生藥毒性和抗藥性,對(duì)人體的健康帶來(lái)威脅。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜,目前食品中抗生素殘留的定量檢測(cè)仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此,迫切需要發(fā)展高效的樣品前處理技術(shù),建立高選擇性和高靈敏度的抗生素殘留分離/富集和分析方法。磁性固相萃取作為固相萃取的一種新型模式,具有操作簡(jiǎn)便、富集效率高、成本低、有機(jī)溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn),是樣品前處理領(lǐng)域極具活力的預(yù)富集技術(shù)之一。核酸適配體是一類新型的識(shí)別分子,由一小段寡核苷酸通過(guò)分子內(nèi)堿基堆積、疏水作用、氫鍵和靜電作用折疊形成獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四鏈體等),從而特異性地識(shí)別靶分子。與抗體相比,核酸適配體具有分子量小、穩(wěn)定性好、易修飾、能可逆變性與復(fù)性等優(yōu)勢(shì)。目前,適配體已用于多種檢測(cè)方法,包括比色法、熒光法、電化學(xué)法等,其中熒光法因其檢測(cè)限低,選擇性高,信號(hào)響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn),而受到廣泛關(guān)注。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種基于適配體的熒光分析法,但是大部分需要對(duì)適配體進(jìn)行修飾,此過(guò)程耗時(shí),價(jià)格昂貴,且修飾的熒光基團(tuán)(或猝滅基團(tuán))可能會(huì)影響適配體的親和力和特異性。因此,開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單,靈敏,快速的適配體非標(biāo)記型熒光分析法具有重要意義。三螺旋DNA分子開(kāi)關(guān)由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針和非標(biāo)記適配體序列組成,是通過(guò)Watson-Crick和Hoogsteen堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,形成的一種特殊結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有通用性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。DNA插入型染料是非標(biāo)記熒光分析法中最為常見(jiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,其單獨(dú)存在于水溶液中時(shí)熒光強(qiáng)度極弱;當(dāng)其嵌入DNA結(jié)構(gòu)中時(shí),熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。硫黃素T是一種可誘導(dǎo)富含G的寡核苷酸序列形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的染料,其具有成本低,水溶性好,背景信號(hào)低和使用簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本文在前人工作的基礎(chǔ)上,將適配體高特異性和高親和性的特點(diǎn)與磁性固相萃取富集效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,制備了一種基于適配體的磁性固相萃取吸附劑,將其用于選擇性富集氯霉素,結(jié)合高效液相色譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)了食品中氯霉素殘留的高效富集和靈敏檢測(cè);基于三螺旋DNA分子開(kāi)關(guān)以及染料硫黃素T,分別建立了兩種基于適配體的熒光分析法,用于食品中氯霉素和卡那霉素的選擇性檢測(cè)。具體內(nèi)容如下:(1)合成了基于適配體功能化的四氧化三鐵/氧化石墨烯(Fe_3O_4/GO/Apt)材料,并將其作為磁性固相萃取吸附劑,用于氯霉素的選擇性富集,結(jié)合高效液相色譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)了氯霉素的選擇性富集和檢測(cè)。采用改進(jìn)的Hummers法合成氧化石墨烯,然后通過(guò)化學(xué)沉淀法合成Fe_3O_4/GO復(fù)合材料,最后將適配體通過(guò)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共價(jià)連接到Fe_3O_4/GO復(fù)合材料表面,制得Fe_3O_4/GO/Apt。研究了pH,萃取時(shí)間,萃取溫度,洗脫劑的種類和體積以及洗脫時(shí)間等條件對(duì)萃取效率的影響。在最優(yōu)條件(pH為7.0,萃取時(shí)間為5 h,萃取溫度為25℃,洗脫劑為甲醇,洗脫劑體積為1.0 mL,洗脫時(shí)間為6 min)下,氯霉素濃度和峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍為7.0-1.0×10~3μg L~(-1),相關(guān)系數(shù)為0.9994,檢出限和定量限分別為0.24μg L~(-1)和0.79μg L~(-1)。將建立的方法用于蜂蜜和牛奶樣品中氯霉素的分析檢測(cè),回收率分別在85.5%-105.0%之間以及80.5%-101.0%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別低于8.6%和8.9%。(2)構(gòu)建了基于核酸適配體的三螺旋DNA分子開(kāi)關(guān)(Triple helix molecular switch,THMS),結(jié)合熒光分析法,用于氯霉素的檢測(cè)。THMS主要由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)探針(signal transduction probe,STP,兩端分別修飾了熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)的一小段堿基序列)和適配體組成。當(dāng)STP單獨(dú)存在時(shí),由于其兩端修飾的熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)相互靠近,會(huì)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致熒光猝滅,此時(shí)體系的熒光強(qiáng)度極弱;當(dāng)加入適配體之后,適配體會(huì)與STP之間通過(guò)Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對(duì)原理形成THMS結(jié)構(gòu),此時(shí)STP的熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)彼此遠(yuǎn)離,使得熒光恢復(fù),體系熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng);當(dāng)加入目標(biāo)物氯霉素后,適配體會(huì)特異性識(shí)別氯霉素并與之結(jié)合,THMS結(jié)構(gòu)遭到破壞,STP被釋放并游離出來(lái),體系熒光強(qiáng)度降低�；�于上述原理,研究了適配體臂段長(zhǎng)度,緩沖液pH和Mg~(2+)濃度以及THMS形成時(shí)間等因素對(duì)熒光強(qiáng)度和熒光猝滅效率的影響。在最優(yōu)條件(適配體臂段為9個(gè)堿基,pH為6.5,Mg~(2+)濃度為2.5 mmol L~(-1),THMS形成時(shí)間為30 min)下,氯霉素濃度和熒光猝滅量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍為5.0-2.0×10~2 nmol L~(-1),相關(guān)系數(shù)為0.9963,檢出限為1.2 nmol L~(-1)。將該方法用于蜂蜜樣品中氯霉素的分析檢測(cè),回收率在84.5%-103.0%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于4.6%。該方法結(jié)合了三螺旋DNA分子開(kāi)關(guān)通用性、穩(wěn)定性好的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)以及核酸適配體良好的特異性,使其在抗生素分析檢測(cè)方面具有良好的應(yīng)用前景。(3)基于核酸適配體和硫黃素-T(Thioflavin T,ThT),構(gòu)建了一種非標(biāo)記型熒光適配體傳感器用于卡那霉素的分析檢測(cè)。當(dāng)ThT單獨(dú)存在于水溶液中時(shí),體系的熒光強(qiáng)度極弱;當(dāng)加入適配體(富含G堿基的單鏈DNA,易形成G-四鏈體構(gòu)型)后,ThT會(huì)插入適配體結(jié)構(gòu)中,使得體系熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。當(dāng)加入目標(biāo)物卡那霉素后,適配體會(huì)特異性識(shí)別卡那霉素并與之結(jié)合,ThT被釋放,體系熒光強(qiáng)度顯著降低�；�于上述實(shí)驗(yàn)原理,研究了反應(yīng)介質(zhì),適配體濃度,ThT濃度以及適配體與ThT之間的反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)熒光強(qiáng)度和熒光猝滅效率的影響。在最優(yōu)條件(反應(yīng)介質(zhì)為超純水,適配體濃度為0.5μmol L~(-1),ThT為2.0μmol L~(-1),適配體與ThT反應(yīng)時(shí)間為20 min)下,卡那霉素濃度的對(duì)數(shù)與熒光猝滅量之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍在5.0×10~(-2)-2.0×10μmol L~(-1)之間,相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.9919,檢出限為0.01μmol L~(-1)。將該方法用于牛奶樣品中卡那霉素的檢測(cè),回收率在85.4%-105.4%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.7%。
【學(xué)位單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：O657.3;TS207.5
【部分圖文】：

圖 1.1 適配體的篩選過(guò)程酸適配體的特點(diǎn)體對(duì)目標(biāo)物具有特異性，因此也被稱作“化學(xué)抗體”[50]。與很多優(yōu)勢(shì)[51-55]，這些優(yōu)勢(shì)使其具有廣闊的應(yīng)用前景。）不依賴生物體，可體外篩選，易人工合成。隨著 SELEX 技適配體的篩選速度越來(lái)越快。）靶標(biāo)分子種類多。適配體的靶分子有抗生素，多肽，氨基酸理論上講，只要寡核苷酸文庫(kù)足夠大，可以通過(guò) SELEX 技術(shù)質(zhì)的適配體。）特異性高。核酸適配體是經(jīng)過(guò)多次嚴(yán)格篩選獲得的，與靶標(biāo)可以識(shí)別細(xì)微變化。）熱穩(wěn)定性好，有利于保存和運(yùn)輸。

.1 β-內(nèi)酰胺類1.1 氨芐西林青霉素抗性菌株的出現(xiàn)促使人們尋找新的抗生素，從中發(fā)現(xiàn)了半合成的如氨芐西林。該抗生素是一種廣泛用于獸醫(yī)學(xué)的廣譜抗生素[82]。Luo金納米粒子修飾的磁珠復(fù)合物（AuNPs/MBs）和切口酶開(kāi)發(fā)了一種用芐西林的熒光適配體傳感器（圖 1.2）。在聚乙烯亞胺（PEI）存在下合Ps/MBs，其具有優(yōu)異的磁分離性能和強(qiáng)大的共價(jià)生物結(jié)合能力。在氨在下，氨芐西林和適配體之間的特異性結(jié)合，導(dǎo)致適配體的部分互DNA）釋放，釋放的 cDNA 啟動(dòng)切口酶輔助信號(hào)放大（NEASA）循環(huán)。下該方法的線性范圍為 0.1 - 100 ng mL-1，檢測(cè)限為 0.07 ng mL-1。此外體傳感器還成功用于實(shí)際樣品中氨芐西林的檢測(cè)。

圖 1.3 新型電化學(xué)適配體傳感器用于檢測(cè)青霉素的示意圖氨基糖苷類卡那霉素ang 等[85]開(kāi)發(fā)了一種基于液晶的適配體傳感器用于測(cè)定卡那霉素（霉素適配體與 N，N-二甲基-N-（3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基）氰化物（DMOAP）一起固定在載玻片上，此時(shí)液晶膜的取向垂直霉素時(shí)，適配體會(huì)與卡那霉素結(jié)合，破壞液晶的定向排列，從而導(dǎo)粉紅色變?yōu)榫G色。該方法具有較高的特異性，檢出限低至 1 nmo于實(shí)驗(yàn)室的卡那霉素分析方法不同，該方法不需要儀器讀數(shù)，在現(xiàn)測(cè)方面非常有益。
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