發(fā)布時間：2020-11-23 16:17

　　 抗生素在動物源食品中的殘留會通過食物鏈進入人體,當人體攝入含有抗生素殘留的食物,會造成抗生素的體內積累,從而產生藥毒性和抗藥性,對人體的健康帶來威脅。由于樣品基質復雜,目前食品中抗生素殘留的定量檢測仍面臨巨大挑戰(zhàn)。因此,迫切需要發(fā)展高效的樣品前處理技術,建立高選擇性和高靈敏度的抗生素殘留分離/富集和分析方法。磁性固相萃取作為固相萃取的一種新型模式,具有操作簡便、富集效率高、成本低、有機溶劑消耗少等優(yōu)點,是樣品前處理領域極具活力的預富集技術之一。核酸適配體是一類新型的識別分子,由一小段寡核苷酸通過分子內堿基堆積、疏水作用、氫鍵和靜電作用折疊形成獨特的三維結構(如發(fā)夾、假結、凸環(huán)、G-四鏈體等),從而特異性地識別靶分子。與抗體相比,核酸適配體具有分子量小、穩(wěn)定性好、易修飾、能可逆變性與復性等優(yōu)勢。目前,適配體已用于多種檢測方法,包括比色法、熒光法、電化學法等,其中熒光法因其檢測限低,選擇性高,信號響應快等優(yōu)點,而受到廣泛關注。目前已經開發(fā)了多種基于適配體的熒光分析法,但是大部分需要對適配體進行修飾,此過程耗時,價格昂貴,且修飾的熒光基團(或猝滅基團)可能會影響適配體的親和力和特異性。因此,開發(fā)簡單,靈敏,快速的適配體非標記型熒光分析法具有重要意義。三螺旋DNA分子開關由信號轉導探針和非標記適配體序列組成,是通過Watson-Crick和Hoogsteen堿基互補配對原理,形成的一種特殊結構。該結構具有通用性好、穩(wěn)定性強的結構優(yōu)勢。DNA插入型染料是非標記熒光分析法中最為常見的信號轉導分子,其單獨存在于水溶液中時熒光強度極弱;當其嵌入DNA結構中時,熒光強度顯著增強。硫黃素T是一種可誘導富含G的寡核苷酸序列形成G-四鏈體結構的染料,其具有成本低,水溶性好,背景信號低和使用簡單等優(yōu)點。本文在前人工作的基礎上,將適配體高特異性和高親和性的特點與磁性固相萃取富集效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點相結合,制備了一種基于適配體的磁性固相萃取吸附劑,將其用于選擇性富集氯霉素,結合高效液相色譜技術,實現(xiàn)了食品中氯霉素殘留的高效富集和靈敏檢測;基于三螺旋DNA分子開關以及染料硫黃素T,分別建立了兩種基于適配體的熒光分析法,用于食品中氯霉素和卡那霉素的選擇性檢測。具體內容如下:(1)合成了基于適配體功能化的四氧化三鐵/氧化石墨烯(Fe_3O_4/GO/Apt)材料,并將其作為磁性固相萃取吸附劑,用于氯霉素的選擇性富集,結合高效液相色譜技術,實現(xiàn)了氯霉素的選擇性富集和檢測。采用改進的Hummers法合成氧化石墨烯,然后通過化學沉淀法合成Fe_3O_4/GO復合材料,最后將適配體通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共價連接到Fe_3O_4/GO復合材料表面,制得Fe_3O_4/GO/Apt。研究了pH,萃取時間,萃取溫度,洗脫劑的種類和體積以及洗脫時間等條件對萃取效率的影響。在最優(yōu)條件(pH為7.0,萃取時間為5 h,萃取溫度為25℃,洗脫劑為甲醇,洗脫劑體積為1.0 mL,洗脫時間為6 min)下,氯霉素濃度和峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關系,線性范圍為7.0-1.0×10~3μg L~(-1),相關系數(shù)為0.9994,檢出限和定量限分別為0.24μg L~(-1)和0.79μg L~(-1)。將建立的方法用于蜂蜜和牛奶樣品中氯霉素的分析檢測,回收率分別在85.5%-105.0%之間以及80.5%-101.0%之間,相對標準偏差分別低于8.6%和8.9%。(2)構建了基于核酸適配體的三螺旋DNA分子開關(Triple helix molecular switch,THMS),結合熒光分析法,用于氯霉素的檢測。THMS主要由信號轉導探針(signal transduction probe,STP,兩端分別修飾了熒光基團和猝滅基團的一小段堿基序列)和適配體組成。當STP單獨存在時,由于其兩端修飾的熒光基團與猝滅基團相互靠近,會發(fā)生熒光共振能量轉移,導致熒光猝滅,此時體系的熒光強度極弱;當加入適配體之后,適配體會與STP之間通過Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對原理形成THMS結構,此時STP的熒光基團和猝滅基團彼此遠離,使得熒光恢復,體系熒光強度顯著增強;當加入目標物氯霉素后,適配體會特異性識別氯霉素并與之結合,THMS結構遭到破壞,STP被釋放并游離出來,體系熒光強度降低�；�于上述原理,研究了適配體臂段長度,緩沖液pH和Mg~(2+)濃度以及THMS形成時間等因素對熒光強度和熒光猝滅效率的影響。在最優(yōu)條件(適配體臂段為9個堿基,pH為6.5,Mg~(2+)濃度為2.5 mmol L~(-1),THMS形成時間為30 min)下,氯霉素濃度和熒光猝滅量之間呈現(xiàn)良好的線性關系,線性范圍為5.0-2.0×10~2 nmol L~(-1),相關系數(shù)為0.9963,檢出限為1.2 nmol L~(-1)。將該方法用于蜂蜜樣品中氯霉素的分析檢測,回收率在84.5%-103.0%之間,相對標準偏差低于4.6%。該方法結合了三螺旋DNA分子開關通用性、穩(wěn)定性好的結構優(yōu)勢以及核酸適配體良好的特異性,使其在抗生素分析檢測方面具有良好的應用前景。(3)基于核酸適配體和硫黃素-T(Thioflavin T,ThT),構建了一種非標記型熒光適配體傳感器用于卡那霉素的分析檢測。當ThT單獨存在于水溶液中時,體系的熒光強度極弱;當加入適配體(富含G堿基的單鏈DNA,易形成G-四鏈體構型)后,ThT會插入適配體結構中,使得體系熒光強度顯著增強。當加入目標物卡那霉素后,適配體會特異性識別卡那霉素并與之結合,ThT被釋放,體系熒光強度顯著降低�；�于上述實驗原理,研究了反應介質,適配體濃度,ThT濃度以及適配體與ThT之間的反應時間等因素對熒光強度和熒光猝滅效率的影響。在最優(yōu)條件(反應介質為超純水,適配體濃度為0.5μmol L~(-1),ThT為2.0μmol L~(-1),適配體與ThT反應時間為20 min)下,卡那霉素濃度的對數(shù)與熒光猝滅量之間呈現(xiàn)良好的線性關系,線性范圍在5.0×10~(-2)-2.0×10μmol L~(-1)之間,相關系數(shù)可以達到0.9919,檢出限為0.01μmol L~(-1)。將該方法用于牛奶樣品中卡那霉素的檢測,回收率在85.4%-105.4%之間,相對標準偏差小于5.7%。
【學位單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：O657.3;TS207.5
【部分圖文】：

圖 1.1 適配體的篩選過程酸適配體的特點體對目標物具有特異性，因此也被稱作“化學抗體”[50]。與很多優(yōu)勢[51-55]，這些優(yōu)勢使其具有廣闊的應用前景。）不依賴生物體，可體外篩選，易人工合成。隨著 SELEX 技適配體的篩選速度越來越快。）靶標分子種類多。適配體的靶分子有抗生素，多肽，氨基酸理論上講，只要寡核苷酸文庫足夠大，可以通過 SELEX 技術質的適配體。）特異性高。核酸適配體是經過多次嚴格篩選獲得的，與靶標可以識別細微變化。）熱穩(wěn)定性好，有利于保存和運輸。

.1 β-內酰胺類1.1 氨芐西林青霉素抗性菌株的出現(xiàn)促使人們尋找新的抗生素，從中發(fā)現(xiàn)了半合成的如氨芐西林。該抗生素是一種廣泛用于獸醫(yī)學的廣譜抗生素[82]。Luo金納米粒子修飾的磁珠復合物（AuNPs/MBs）和切口酶開發(fā)了一種用芐西林的熒光適配體傳感器（圖 1.2）。在聚乙烯亞胺（PEI）存在下合Ps/MBs，其具有優(yōu)異的磁分離性能和強大的共價生物結合能力。在氨在下，氨芐西林和適配體之間的特異性結合，導致適配體的部分互DNA）釋放，釋放的 cDNA 啟動切口酶輔助信號放大（NEASA）循環(huán)。下該方法的線性范圍為 0.1 - 100 ng mL-1，檢測限為 0.07 ng mL-1。此外體傳感器還成功用于實際樣品中氨芐西林的檢測。

圖 1.3 新型電化學適配體傳感器用于檢測青霉素的示意圖氨基糖苷類卡那霉素ang 等[85]開發(fā)了一種基于液晶的適配體傳感器用于測定卡那霉素（霉素適配體與 N，N-二甲基-N-（3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基）氰化物（DMOAP）一起固定在載玻片上，此時液晶膜的取向垂直霉素時，適配體會與卡那霉素結合，破壞液晶的定向排列，從而導粉紅色變?yōu)榫G色。該方法具有較高的特異性，檢出限低至 1 nmo于實驗室的卡那霉素分析方法不同，該方法不需要儀器讀數(shù)，在現(xiàn)測方面非常有益。
【相似文獻】

相關期刊論文 前17條

1 王舒鶴;周新洋;朱月潔;吳靜;楊振軍;;核酸適配體修飾與包載及其在疾病靶向性治療和檢測中的應用[J];中國藥物化學雜志;2019年06期

2 孫玉瓊;袁寶銀;鄧美桃;王青;羊小海;;核酸適配體序列優(yōu)化策略的研究進展[J];化學傳感器;2018年02期

3 賀宏斌;;核酸適配體在病原生物學中的應用研究進展[J];熱帶病與寄生蟲學;2019年03期

4 許濤;彭智輝;王澤峰;周佳琪;鄧樂;;核酸適配體篩選技術研究進展[J];生物技術通訊;2018年01期

5 汪靖;王進;曾家豫;;核酸適配體結合蛋白質靶標的親和力表征方法及其在疾病診斷中的應用[J];中國生物化學與分子生物學報;2018年04期

6 李亞楠;趙潔;張傲哲;譚琰;華茜;張子劍;;核酸適配體的體外篩選方法的最新研究進展[J];生物技術通報;2017年04期

7 胡濤;楊帆;楊秀榮;;雙偏振極化干涉技術實時研究三磷酸腺苷與其適配體相互作用[J];分析化學;2017年07期

8 劉洪美;欒云霞;陸安祥;陳佳祎;李成;王紀華;;核酸適配體在小分子目標物快速檢測中的應用[J];食品安全質量檢測學報;2017年08期

9 陳爾凝;趙新穎;屈鋒;;細菌的核酸適配體篩選的研究進展[J];色譜;2016年04期

10 ;中科大篩選出特異針對點突變蛋白的適配體[J];中國科學院院刊;2015年05期

11 ;中國科學技術大學篩選出特異針對點突變蛋白的適配體[J];中國材料進展;2015年Z1期

12 仲津漫;劉鴿;文娣娣;宦怡;任靜;;前列腺癌適配體的研究進展及其應用[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年29期

13 董理權;吳小高;;構建輔助器具適配體系探討[J];殘疾人研究;2014年02期

14 王開;裴志花;曲桂娟;馬紅霞;;適配體藥物的研究現(xiàn)狀及其在傳染病防制領域的應用前景[J];中國預防獸醫(yī)學報;2013年04期

15 ;生物分析中的核酸適配體[J];分析化學;2012年05期

16 申睿;唐吉軍;張朝陽;郭磊;謝劍煒;;基于磁珠分離的酶聯(lián)適配體檢測痕量蛋白質的新型比色分析方法[J];高等學�；瘜W學報;2009年04期

17 張月俠;宋茂勇;李濤;賽道建;汪海林;;適配體的篩選及在生命分析化學中的應用[J];生物技術;2009年05期

相關博士學位論文 前10條

1 李陳;基于適配體的微懸臂陣列傳感器在生物化學檢測中的應用[D];中國科學技術大學;2019年

2 李兆奕;新型雙特異性核酸適配體對NK細胞抗腺癌殺傷效應的增強作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2019年

3 洪珊妮;功能化核酸適配體用于活細胞成像與癌癥靶向治療[D];中國科學技術大學;2019年

4 李文凱;基于核酸適配體的幾種致病微生物新型檢測與防治方法的建立與應用[D];湖南師范大學;2017年

5 葉華;脂多糖廣譜型核酸適配體的定向篩選、序列優(yōu)化及分析應用[D];江南大學;2019年

6 應站明;遺傳編碼核糖核酸生物傳感新方法研究[D];湖南大學;2018年

7 程莉娟;功能核酸控制沙門氏菌致病性的研究[D];湖南師范大學;2018年

8 李發(fā)蘭;牛奶氨基糖苷類抗生素殘留的適配體傳感器制備方法研究[D];東北農業(yè)大學;2018年

9 杜曉嬌;農產品中微囊藻毒素檢測用氮雜石墨烯基電化學適配體傳感器的研究[D];江蘇大學;2018年

10 白云龍;基于適配體毛細管電泳法與熒光開關法檢測蛋白質[D];山西大學;2018年

相關碩士學位論文 前10條

1 喬斌;基于適配體的腫瘤外泌體的電化學分析檢測[D];南京師范大學;2019年

2 唐曉娣;基于免疫磁珠和適配體標記的微囊藻毒素傳感器研究[D];浙江師范大學;2019年

3 屠春燕;基于適配體的食品中抗生素殘留分析[D];浙江師范大學;2019年

4 黃遠祥;核酸適配體功能材料選擇性吸附霉菌毒素的研究及其在乳制品檢測中的應用[D];廣東藥科大學;2019年

5 譚靖威;基于納米金適配體傳感器激光誘導檢測凝血酶的研究[D];中國醫(yī)科大學;2019年

6 陳查丹;基于適配體傳感器對凝血酶蛋白檢測的新方法研究[D];江西中醫(yī)藥大學;2019年

7 孫翔玉;基于功能性適配體修飾的磁性納米粒子載藥體系構建及抗腫瘤活性研究[D];廣東藥科大學;2019年

8 邵坤;基于適配體納米磁珠的黃曲霉毒素B1萃取及檢測方法研究[D];西華大學;2019年

9 汪勝;基于適配體功能化碳納米管的細菌生物膜控制方法研究[D];湖南師范大學;2017年

10 林燕娜;銅基MOFs復合材料在化學發(fā)光適配體傳感器中的應用[D];濟南大學;2019年

本文編號：2894766