發(fā)布時(shí)間：2024-07-06 10:04

　　肝素酶來源于肝素黃桿菌,是一類能夠特異性降解肝素和乙酰肝素的多糖裂解酶。目前研究發(fā)現(xiàn),肝素酶在制備低分子量肝素、抑制腫瘤細(xì)胞增殖,清除血液中殘留肝素等方面具有重要的生物學(xué)作用,受到越來越多人的關(guān)注。目前研究最多的是肝素酶Ⅰ,肝素酶Ⅰ在重組大腸桿菌中可溶性表達(dá)低,導(dǎo)致其產(chǎn)量較低,純化較難,成本較高等問題,限制了其在醫(yī)藥方面的應(yīng)用。因此尋找合適的方法來提高肝素酶Ⅰ的產(chǎn)量和純度具有重要的意義。分子伴侶素CpkA是從嗜熱菌Thermococcus kodakarensis中發(fā)現(xiàn)的耐熱伴侶蛋白,具有輔助蛋白折疊功能和ATPase活性。本文構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYC-CpkA和切去前導(dǎo)肽并加上帶正電signal-tag的HepI’-28a質(zhì)粒,并以單轉(zhuǎn)或共轉(zhuǎn)化形式轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DE3(BL21)中誘導(dǎo)表達(dá),通過鎳柱純化,除鹽柱除鹽,陽離子交換柱層析等優(yōu)化純化方式獲得可溶性的HepI’蛋白;同時(shí)在E.coli DE3-RIPL中原核表達(dá)分子伴侶素CpkA,經(jīng)85℃熱處理1h、飽和度為80%的硫酸銨沉淀、透析除鹽和陰離子交換柱層析,獲得高純度CpkA蛋白;利用本文制備的分子伴侶素CpkA蛋白在...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1肝素基本結(jié)構(gòu)圖

第一章緒論1第一章緒論1.1肝素19世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)在動物組織中含有能夠抑制血液凝結(jié)的物質(zhì)，1922年Howell最早將其從動物肝臟中提取分離出來，并正式將其命名為肝素（unfractionatedheparin，UFH）[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，肝素的結(jié)構(gòu)逐漸被大家所了....

圖1.2GroEL/ES的結(jié)構(gòu)[46]

第一章緒論6端和赤道區(qū)，起傳遞信號的功能。GroES[48]因?yàn)閷Ψ肿影閭HGroEL的復(fù)性功能有輔助作用，又被稱為協(xié)同分子伴侶。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)表明分子伴侶GroEL/ES在可以幫助底物蛋白在大腸桿菌中正確折疊[49,50]，在翻譯中和翻譯后起作用[51]。GroEL/ES通過靜電作用....

圖2.1HepI基因序列

第二章肝素酶I的原核表達(dá)8第二章肝素酶I的原核表達(dá)通過NCBI網(wǎng)站的GeneBank數(shù)據(jù)庫和查詢文獻(xiàn)[33]，最終確定肝素酶I（HepI）的堿基序列，全長1155bp。利用NEBcutterV2.0對HepI的序列進(jìn)行分析，并與pET-28a中多克隆位點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行比對，確定在基因5....

圖2.2HepI-28a質(zhì)粒的提取與PCR驗(yàn)證結(jié)果圖

第二章肝素酶I的原核表達(dá)17圖2.2HepI-28a質(zhì)粒的提取與PCR驗(yàn)證結(jié)果圖1:HepI-28a質(zhì)粒;2和3:以HepI-28a為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物;M:DNAMarkerDL150002.3.2測序驗(yàn)證將初步篩選出來的質(zhì)粒送到庫美公司測序，利用NCBIBlast將測....

本文編號：4002436