發(fā)布時(shí)間：2018-04-22 22:27

  本文選題：Tssk6 + Izumo1��； 參考：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：哺乳動(dòng)物的受精作用是一個(gè)精密且復(fù)雜的生理過程,主要包括精子獲能、精子與卵子透明帶結(jié)合引發(fā)頂體反應(yīng)、精子和卵子膜融合三個(gè)主要過程。精子膜上的蛋白質(zhì)之間的相互作用為之后的精卵融合創(chuàng)造了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),近來研究表明,鼠精子特異性蛋白精卵融合蛋白IZUMO1在精子膜上的運(yùn)動(dòng)跟另一個(gè)精子特異性蛋白激酶TSSK6有關(guān),但是兩者之間是否有直接的相互作用還沒有被證明。本文用酵母雙雜交、免疫共沉淀和哺乳動(dòng)物雙雜交技術(shù)鑒定了 IZUMO1與TSSK6之間的相互作用。本實(shí)驗(yàn)選取綿羊的睪丸組織,克隆出長(zhǎng)度為985 bp的Tssk6的cDNA全長(zhǎng),并上傳至NCBI,登錄號(hào)為KY914489。其中CDS區(qū)中的第144位和672位堿基與GenBank預(yù)測(cè)的序列存在差異,但沒有發(fā)生氨基酸改變。將Tssk6和本實(shí)驗(yàn)室已有的綿羊Izumo1 cDNA分別插入pGEX-4T1構(gòu)建pGEX-Tssk6和pGEX-Izumo1原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白TSSK6-GST和IZUMO1-GST,提取純化后分別免疫小鼠和家兔,得到兔抗的IZUMO1血清抗體和鼠抗的TSSK6血清抗體。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,我們把轉(zhuǎn)化了pGAD-Tssk6的Y2H酵母菌和轉(zhuǎn)化了Pgbk-Izumo1的Y187酵母菌進(jìn)行雜交,雜交后代可以在SD/-Trp-Leu二缺培養(yǎng)基和SD/-Ade-His-Trp-Leu培養(yǎng)基上分別長(zhǎng)出藍(lán)色菌落,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TSSK6和IZUMO1在酵母細(xì)胞中發(fā)生了相互作用。在哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)中,把pFN-10A-Izumo1/pFN-11A-Tssk6和報(bào)告基因載體PGL4.31共轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞,然后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。其中陽(yáng)性對(duì)照組p0.05,實(shí)驗(yàn)組p0.01,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IZUMO1和TSSK6在人293T細(xì)胞中發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中,我們將pCMV-Flag-Tssk6和pCMV-HA-Izumo1載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,·然后使用抗HA標(biāo)簽的磁珠抗體對(duì)IZUMO1-HA進(jìn)行沉淀,用抗Flag標(biāo)簽的抗體進(jìn)行Western-blot檢測(cè),蛋白印跡結(jié)果顯示IZUMO1-HA蛋白與TSSK6-Flag蛋白一起被沉淀下來,這說明TSSK6和IZUMO1在293T細(xì)胞中是結(jié)合在一起的。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們可以確定IZUMO1和TSSK6之間發(fā)生了直接的相互作用。
[Abstract]:The fertilization of mammals is a precise and complex physiological process, mainly including sperm capacitation, the combination of sperm and the oval zona pellucida triggering acrosome reaction, and the fusion of sperm and egg membrane three main processes. The interaction between the proteins on the sperm membrane creates a structural basis for the subsequent fusion of sperm and eggs. Recent studies have shown that the rat The movement of sperm specific egg fusion protein IZUMO1 on the sperm membrane is related to another sperm specific protein kinase TSSK6. But whether there is a direct interaction between them has not been proved. In this paper, the interaction between IZUMO1 and TSSK6 was identified by yeast two hybrid, CO immunoprecipitation and mammalian two hybrid techniques. In this experiment, we selected the testis tissue of sheep and cloned the full length of Tssk6 cDNA length of 985 BP, and uploaded to NCBI. The login number was KY914489. in the CDS region and the 672 base bases were different from the GenBank predicted sequences, but there was no amino acid change. Tssk6 and the existing sheep Izumo1 cDNA in our laboratory were inserted into pG, respectively. EX-4T1 constructed the prokaryotic expression vector of pGEX-Tssk6 and pGEX-Izumo1, expressed recombinant protein TSSK6-GST and IZUMO1-GST in Escherichia coli, and immunized mice and rabbits after extraction and purified respectively. The Rabbit anti IZUMO1 serum antibody and mouse anti TSSK6 serum antibody were obtained. In the yeast two hybrid experiment, we transformed the Y2H yeast and transformation of pGAD-Tssk6. The Pgbk-Izumo1 Y187 yeast was hybridized. The hybrid progeny could grow blue colonies on the SD/-Trp-Leu two deficient medium and the SD/-Ade-His-Trp-Leu medium. The experimental results showed that the interaction between TSSK6 and IZUMO1 had occurred in the yeast cells. In the two hybrid experiment of mammalian, the pFN-10A-Izumo1/pFN-11A-Tssk6 and the report base were used. The carrier PGL4.31 was co transfected with human 293T cells, then the double luciferase reporter gene was detected and the results were statistically analyzed. The positive control group, P0.05, and the experimental group P0.01, showed that IZUMO1 and TSSK6 had a stronger interaction in human 293T cells. In the immunoprecipitation experiment, we will have pCMV-Flag-Tss The K6 and pCMV-HA-Izumo1 vectors co transfected 293T cells. Then the IZUMO1-HA was precipitated with the anti HA labeled magnetic bead antibody, and the Western-blot detection was carried out with the antibody labeled Flag. The Western blot results showed that the IZUMO1-HA protein was precipitated together with the TSSK6-Flag protein, which indicates that TSSK6 and IZUMO1 are combined in the 293T cells. Based on the above results, we can determine the direct interaction between IZUMO1 and TSSK6.

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78;S826

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本文編號(hào)：1789224