發(fā)布時間：2020-11-22 02:11

　　 植物在進化中形成了一系列適應(yīng)環(huán)境的機制,膜聯(lián)蛋白就是其中之一,它在植物生長發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用。本課題以“川蕎3號”為研究對象,對苦蕎膜聯(lián)蛋白基因及其啟動子進行了克隆鑒定,探討該基因的結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系、亞細胞分布、組織表達模式,及其參與苦蕎逆境脅迫的應(yīng)答模式,為進一步培育抗逆植物奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1.采用RACE克隆了一條苦蕎膜聯(lián)蛋白基因,命名為FtANX1。DNA全長1650bp,含5個外顯子,4個內(nèi)含子。CDS全長942 bp,編碼313個氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量36.06 KDa,等電點5.94。FtANX1具有4個典型的annexin保守域,全α-螺旋結(jié)構(gòu),含1個典型的Ⅱ型Ca2+結(jié)合位點。FtANX1氨基酸序列與其他膜聯(lián)蛋白相似度在49-60%之間。翻譯后修飾位點預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白含10個磷酸化位點,1個N-豆蔻�；�位點及1個細胞附著位點。Swiss-Model進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)其與甜椒AnnCaP32三維結(jié)構(gòu)相似度最高(50.16%)。聚類分析顯示,植物膜聯(lián)蛋白分為四大類,FtANX1與棉花AnnGh5、草莓Annfaf和苜蓿AnnMt1屬于第二類。2.利用genome walking技術(shù)獲得FtANX1基因翻譯起始密碼子(ATG)上游長約1563 bp序列。序列分析顯示其具有啟動子基本的核心元件,轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)距ATG上游54 bp；TATA-box距TSS上游31 bp。PLACE數(shù)據(jù)庫分析表明該啟動子含較多生物或非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。3.采用qRT-PCR技術(shù)分析FtANX1在苦蕎花期組織中的表達情況,發(fā)現(xiàn)該基因在所檢測的組織中均有表達,在未成熟果實中表達量最高,成熟果實、花、莖、根中表達量次之,葉中表達量最少,與果實發(fā)育過程密切相關(guān)。4.采用qRT-PCR技術(shù)分析FtANX1在苦蕎逆境脅迫下的表達模式,結(jié)果表明：與對照相比,JA、UV-B處理下,FtANX1表達量在24 h時分別增加到9.79+0.89、10.71±0.40；NaCl處理下,FtANX1轉(zhuǎn)錄水平增加,且在12h時較高；寒冷和干旱脅迫下,FtANX1 mRNA積累量在12 h時表現(xiàn)出明顯的增加,在24 h時分別進一步增加至17.39±0.24、17.6±1.60：Cu和Pb處理下,FtANX1表達量明顯增加；Zn處理7d時,FtANX1表達量增加,但14d時其表達量急劇下降；Fe和Cd處理7d時, FtANX1 mRNA積累量下降,14d時其積累量增加,且Cd處理下其積累量增加了1倍；Ni、Mn處理導(dǎo)致FtANX1轉(zhuǎn)錄水平顯著下降。本研究表明FtANX1響應(yīng)苦蕎幼苗多種環(huán)境脅迫。5.構(gòu)建p163-GFP-FtANX1表達載體,瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片,對苦蕎膜聯(lián)蛋白FtANX1進行亞細胞定位研究。結(jié)果表明FtANX1蛋白定位于細胞膜中,推測其參與細胞分化、胞外分泌等相關(guān)的生長發(fā)育過程。
【學位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q945.78;Q943.2
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 苦蕎簡介
    1.2 植物膜聯(lián)蛋白簡介
        1.2.1 植物中膜聯(lián)蛋白的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 植物膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)及分布
        1.2.3 植物細胞中膜聯(lián)蛋白的功能
    1.3 植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位簡介
    1.4 高等植物啟動子簡介
        1.4.1 啟動子的概念
        1.4.2 啟動子的基本結(jié)構(gòu)及功能
        1.4.3 啟動子的克隆
    1.5 研究目的及意義
    1.6 技術(shù)路線圖
第二章 苦蕎膜聯(lián)蛋白基因及啟動子的克隆與序列分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 苦蕎總DNA的提取
        2.2.2 苦蕎總RNA的提取
        2.2.3 苦蕎FtANX1基因的克隆
        2.2.4 苦蕎FtANX1基因啟動子的克隆
        2.2.5 苦蕎FtANX1基因序列分析
        2.2.6 苦蕎FtANX1基因啟動子序列分析
    2.3 討論
第三章 苦蕎膜聯(lián)蛋白基因表達模式分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 方法
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 FtANX1基因組織特異性表達分析
        3.2.2 FtANX1基因響應(yīng)環(huán)境脅迫表達分析
    3.3 討論
第四章 苦蕎膜聯(lián)蛋白FtANX1亞細胞定位
    4.1 材料與方法
        4.1.1 植株與試劑
        4.1.2 培養(yǎng)基
        4.1.3 方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 GFP融合表達載體的構(gòu)建
        4.2.2 重組載體在煙草中的瞬時表達
    4.3 討論
結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文

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