發(fā)布時間：2020-10-30 20:29

　　 本課題主要進行了兩部分內容的研究。 1.馬克思克魯維酵母木糖代謝工程改造研究 利用微生物轉化半纖維素生產清潔可再生能源乙醇一直是生物能源研究領域的熱點之一,但是自然界中并沒有可以直接高效轉化半纖維素的微生物菌株。近年來諸多研究利用遺傳工程對釀酒酵母和其他酵母菌株進行遺傳改造以期得到高效發(fā)酵木糖的菌株,其難點在于酵母對五碳糖,尤其木糖的發(fā)酵能力不強。在酵母的木糖代謝路徑中,木糖經(jīng)木糖還原酶形成木糖醇,隨后經(jīng)木糖醇脫氫酶將木糖醇轉換為木酮糖,進一步代謝,最終得到乙醇。研究不同菌株木糖代謝路徑中的相關酶,是進一步研究生物轉化可再生能源等相關問題的基礎。 馬克斯克克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)具有可以和釀酒酵母相媲美的利用葡萄糖發(fā)酵的能力,又有釀酒酵母所不具備的木糖利用及發(fā)酵的能力,因此,在發(fā)酵木糖工程菌的改造方面具有較大潛力,但是其發(fā)酵木糖能力較低。探索馬克思克魯維酵母發(fā)酵木糖的限制性因素是對其改造利用的重要環(huán)節(jié)。本研究主要通過克隆馬克思克魯維酵母木糖還原酶基因Kmxyll,初步研究木糖還原酶的基本性質,并分析其發(fā)酵木糖能力低的可能原因。根據(jù)木糖還原酶氨基酸序列中的保守部分結合TAIL-PCR方法,首次克隆得到馬克思克魯維酵母木糖還原酶基因Xyl1,并測序驗證。在大腸桿菌中重組表達木糖還原酶蛋白并且對其進行一系列的性質測定,闡明馬克思克魯維酵母來源的木糖還原酶的基本性質。馬克思克魯維酵母來源的木糖還原酶的最適輔酶是NADPH,對NADH則沒有活力。因此,木糖還原酶對NADPH的偏好性可能造成馬克思克魯維酵母在利用木糖的代謝途徑中還原力不平衡,從而導致其對木糖的發(fā)酵能力低。為了進一步驗證克隆的木糖還原酶的正確性,我們構建了木糖還原酶基因的敲除菌株YZB001,證明了木糖還原酶基因缺失的馬克思克魯維酵母不能利用木糖生長。為了改善馬克思克魯維酵母在高溫下發(fā)酵木糖生產乙醇的能力,將畢赤酵母(Scheffersomyces stipitis NBRC10063)來源的木糖還原酶(PsXR)及其突變體PsXRN272D和PsXRK21A/N272D轉化進YZB001菌株中。改造后的菌株能大幅提高馬克思克魯維酵母在高溫下利用木糖發(fā)酵生產乙醇的能力,其中PsXRN272D突變體效果最好。同野生型的馬克思克魯維酵母相比,重組馬克思克魯維酵母菌株YZB013(PsXR)和YZB014(PsXRN272D)同對照菌株YHJ010相比,在42℃時用20g/L木糖發(fā)酵分別提高了3.63倍和11.83倍的乙醇產量達到1.10g/L和3.55g/L乙醇。當溫度上升到45℃時,YZB014菌株能發(fā)酵20g/L的木糖產生2.27g/L的乙醇。在以玉米芯酸水解液為發(fā)酵原料在42℃發(fā)酵時,YZB014菌株可以產生4.09g/L乙醇。重組馬克思克魯維菌株展現(xiàn)了其在利用生物質生產生物乙醇的潛力。 2.綠膿桿菌群體響應系統(tǒng)Rhll蛋白的定向進化 隨著具有抗藥性的細菌的出現(xiàn),開發(fā)新型抗菌藥成為一個迫切的任務。抑制群體響應是控制細菌感染的一個有效的途徑,同時,群體響應抑制藥物具有不易引起細菌抗藥性的優(yōu)點。開發(fā)這類高效藥物需要對群體響應的LuxI同源蛋白及其與底物的相互作用的分子機制有清晰的理解。本研究的目標是通過改造LuxI同源酶RhlI的底物特異性來取得LuxI同源酶與底物相互作用分子機制的詳細信息,從而為設計高效抑制綠膿桿菌群體響應系統(tǒng)中RhlI酶的新型抗生素藥物,提供充分而必要的信息。為實現(xiàn)該目標,本研究改造RhlI酶的底物特異性。設計了各種強度的篩選系統(tǒng),利用定向演化,通過改造RhlI使其能夠合成OHHL。通過設計一個綠色熒光蛋白作為信號輸出的篩選和半定量系統(tǒng),在第一輪的篩選過程中,通過三次篩選,篩選到了熒光值比出發(fā)蛋白分別提高了80.02%,167.45%和170.59%的突變體M8,S7和2M26。在此基礎上,構建了第二輪的篩選系統(tǒng),篩選到了突變體4M1產生信號分子激活熒光蛋白的能力比2M26提高了20.27%。這樣通過改變RhlI的底物特異性,我們對于RhlI催化的分子機理就會有一個清晰的理解,為開發(fā)抑制群體響應藥物提供有用而必要的信息。
【學位單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q93
【部分圖文】：

XR-RS1、XR-RS2、XR-RS3。克隆出的序列經(jīng)過測序確認�？寺〕龅腒mxyU基因的氨基酸序列比對結果見圖1.2，克隆出的基因序列及分析見圖1.4。CS7 0 CO=iill 11^ ilil^JinliKm-xR n | _ M I 【■作■？5-XR 67 P I |y<GD?J~Te-XR 69 - ] r、] [: [ 1 ICt-XR 7.1 M 1 ftS'- ^ m 1 1 ,,ONN—Kl-XR 71 譽-I B _、SB W I IKEDEAKt-xR '11 '、屋‘‘BwB TpjPP"'-?I^K'S S 1 ■^^AEDEKKm-XP 141 KE1 ISEli:l|l#H^8HdBi:i::|l.Ei0^^4^KS^?-E3' Z! inVlfiL 2 1Ps->;R 136 …邏K暴孺^ 工、I ‘T?~XR 137 |. iCt-XR 140 ---FVyIiJ P f 2■宏參醫(yī)‘ §、Ki-xR i4i kghieJcJ Sj S llgTOii-1… V gj^7Km—XR 211 AOK'v^fc vMfflHl|HfcNEK L暴.:參 i:醒丨 S M ■ ^K-Ps-XR 203 AQSRfc lMSG|A、TS-XR 204 VQKsjfc KDBFI^pH^Hsfcp | ^ SCt-XR 207 AQK^Ht r^^^K^^BNOGR LHlpT^E^lMWgMJ | m ■K:I -XR 211 vKNftft W ^ |^B'Kt-XB 21) cKocjP^v■琴Pj^^PD.3。rJjks{ki:^^!ii^(K:J — ^ ^oKm-XR 231 KKESBE :...AETFT SDE IKF： NO DQG| 耶r|7_TFs-XR 273 TVfH' ^ tJn-SFD DEQ FAD a ".1 I |"K—t|t,|VTe-XR 2'M NPllvj :暴-秘1) TE.^ S? NKuf ^^?'S|GI.:Y-I|I|ACt-XH 27 7 LPH^hc RSFK-TFLj IKE FEE AK DT'J LjoM - - l|l|vKI-XR 231 KKK^pr： '.KfeDALT XDH LKQ SG MOMI ||ByL"ll.,DNE FITIJKt-KS 2B1 :.Q^EKI.T『‘：~ IBB ：.規(guī)圖1.2不同酵母來源木糖還原酶的序列比對注：下劃線表示兼并引物設計的區(qū)域，活性位點(0),底物結合基團（?)，輔酶結合區(qū)域(▽)分別標識出來，方框顯示的是 ne-Pro-Lys-Ser 模體。A^wXR

Kmxyll同源區(qū)域內的擴增條帶

第1章馬克思克魯維酵母的木糖代謝及其工程改造的研究激轉化的方法將表達質粒轉入大腸打菌中，然后誘導蛋白表達。如圖1.5所示，用已經(jīng)成功克隆的Kmxyll基因，設計引物XR-NDE和XR-HIND并馬克思克魯維酵母的基因組DNA為模版進行PCR反應擴增出目的條帶，同質粒一起酶切并檢測。5 kb3 kb 命2kb : “ "'Vtf*-, ?5* ? ** ??" *i kb . I ?750 bp500隱M 1 2圖1. 5質粒pET21和Kmxyll基因的擴增條帶酶切結果注：M: DL2000 plus II DNA marker： 1： pET21 條帶；2: Kmxyll 基因條帶載體和插入片段回收后連接并熱激轉化進入大腸桿菌。長出的克隆用菌落PCR檢測以初步判斷連接成功與否。5 kb|P* ^ISSB 3 kbp 2 kbflHBBRHH. WfeUi.lit'wuKi''-- 〔-MHSSSaBKmiMMBM '-<1 2 3 4 5 6 7 8 M圖1. 6菌落PCR檢測質粒pET21和KmxyU的連接情況注：M: DL2000 plus II DNA marker： 1-8：陽性克隆構建好表達載體后，轉入到表達菌株E C0//BL21 (DE3)中，進行最優(yōu)表達條件的摸索。接種表達菌株于5 mLLB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，第二天接種1%體積的菌種至7管新的LB中
【共引文獻】

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本文編號：2862969