發(fā)布時(shí)間：2017-12-08 19:14

  本文關(guān)鍵詞：免疫活性乳酸菌的篩選及其抗肉雞沙門氏菌感染的研究

  更多相關(guān)文章： 家禽 乳酸菌 免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞因子 沙門氏菌

【摘要】：家禽被認(rèn)為是沙門氏菌的主要宿主,乳酸菌通過粘附于宿主腸道上皮細(xì)胞表面競(jìng)爭(zhēng)性排斥病原菌在宿主腸道內(nèi)的定植,加強(qiáng)宿主的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答從而有效地控制沙門氏菌對(duì)家禽的感染。此外,通過對(duì)乳酸菌的工程改造,使工程乳酸菌直接將抗炎分子遞送到粘膜表面,能夠有效地治療由病原菌或者化學(xué)物質(zhì)引起的炎癥性疾病。本研究的目的是在常規(guī)篩菌指標(biāo)(乳酸菌的耐酸耐膽鹽、抑菌活性、粘附能力和抗粘附能力)的基礎(chǔ)上,基于體外免疫調(diào)節(jié)活性篩選能夠抵抗沙門氏菌對(duì)肉雞感染的潛在益生菌,并且通過基因工程的方法改造乳酸菌,使其能夠表達(dá)具有生物活性的家禽抗炎細(xì)胞因子IL-10。此外,通過原核表達(dá)及免疫兔子的方法制備家禽細(xì)胞因子LITAF、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12的多克隆抗體,為家禽免疫應(yīng)答的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。1.家禽細(xì)胞因子的原核表達(dá)及抗體的制備從肉雞基因組中PCR克隆了LITAF、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12基因全長(zhǎng)序列,同時(shí)選擇pET-32a(+)或pET-21a(+)作為表達(dá)載體,設(shè)計(jì)限制性酶切位點(diǎn)為Kpn I和Hind III或BamH I和Hind III,將分別編碼基因LITAF、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12抗原決定簇100、268、186、156和141個(gè)氨基酸殘基的核苷酸片段連接至pET-32a(+)或pET-21a(+)上,經(jīng)篩選獲得陽(yáng)性重組子pET-32a(+)-LITAF、pET-32a(+)-IL-1β、pET-32a(+)-IL-6、pET-32a(+)-IL-10和pET-21a(+)-IL-12;將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)或Transetta(DE3)感受態(tài)中,獲得重組表達(dá)的基因工程菌。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,獲得目標(biāo)蛋白多肽。將目的蛋白純化后免疫兔子,制備家禽細(xì)胞因子的多克隆抗體,可用于家禽細(xì)胞因子在蛋白水平上的檢測(cè)。2.免疫調(diào)節(jié)活性和粘附性能泡菜乳酸菌的篩選及抵抗沙門氏菌的研究本文中,從發(fā)酵泡菜中共分離得到16株乳酸菌,并且該16株乳酸菌能夠有效的在模擬的胃腸道環(huán)境中存活和抑制6種病原菌的生長(zhǎng)。其中Lactobacillus rhamnosus P1、Lactobacillus plantarum P2、Lactobacillus rhamnosus P3和Lactobacillus casei P4具有較強(qiáng)的粘附于上皮細(xì)胞Caco-2的能力。此外,與其他三株乳酸菌相比,L.plantarum P2菌株能夠更有效的誘導(dǎo)脾臟單核細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子LITAF和IL-12,以及更有效的抑制腸炎沙門氏菌對(duì)上皮細(xì)胞Caco-2的粘附和侵染。這些結(jié)果表明L.plantarum P2菌株能夠被用作益生菌的候選菌株而抵抗沙門氏菌對(duì)食物的感染。3.雞源性腸道乳酸菌的篩選及對(duì)雛雞感染沙門氏菌的保護(hù)作用在分離獲得的101株乳酸菌中,有13株乳酸菌能夠在酸性(pH 2.5)和不同膽鹽濃度(0.1%~1.0%)的條件下存活,而且該13株乳酸菌還能夠有效地抑制6種病原菌的生長(zhǎng)和粘附于Caco-2細(xì)胞表面。然而,它們的免疫調(diào)節(jié)活性差異很大。最后,選擇三株(Lactobacillus plantarum PZ01,Lactobacillus salivarius JM32和Pediococcus acidilactici JH231)免疫調(diào)節(jié)活性較強(qiáng)的菌株和三株(Enterococcus faecium JS11,Lactobacillus salivarius JK22和Lactobacillus salivarius JM2A1)免疫調(diào)節(jié)活性較弱的菌株,比較它們體外抑制沙門氏菌粘附和侵染Caco-2細(xì)胞的能力,以及它們的體內(nèi)抗菌效果。與后面的三株菌相比較,前面的三株菌在體外抑制沙門氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附和侵染、減少沙門氏菌在腸道內(nèi)容物、脾臟和肝臟中的數(shù)量,以及在病原菌感染試驗(yàn)中,降低血清中LITAF、IL-1β、IL-6和IL-12,以及增加IL-10表達(dá)水平均具有較好的效果。結(jié)果表明,乳酸菌的體外免疫調(diào)節(jié)活性可以作為額外的篩菌指標(biāo),用于篩選作為家禽飼料添加成分的更有效的益生菌。4.表達(dá)家禽抗炎細(xì)胞因子IL-10的工程乳酸菌的構(gòu)建及其生物學(xué)活性的檢測(cè)在構(gòu)建的5株工程乳酸菌中,工程菌株L.casei P4-cIL-10具有最強(qiáng)表達(dá)cIL-10的能力,表達(dá)量為163.8 ng/ml,其次是L.casei LP1-cIL-10、L.rhamnosus P5-cIL-10和L.plantarum PZ01-1-cIL-10,工程菌株L.reuteri LY01-cIL-10檢測(cè)不到cIL-10的表達(dá)。同時(shí),培養(yǎng)的工程菌株L.plantarum PZ01-1-cIL-10、L.casei LP1-cIL-10、L.casei P4-cIL-10和L.rhamnosus P5-cIL-10的菌體部分在預(yù)測(cè)的成熟cIL-10的大小處能夠檢測(cè)到一條清晰的條帶。此外,與野生型菌株和陽(yáng)性對(duì)照組相比,工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10在24 h和48 h時(shí)均能有效地減少由LPS刺激肉雞脾臟單核細(xì)胞后表達(dá)促炎細(xì)胞因子LITAF、IL-1β、IL-6和IL-12的水平,表明工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10比它的野生型菌株具有更好的保護(hù)作用。最后,與野生型菌株L.casei P4相比,工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10同樣具有益生菌性能,包括能夠在模擬的胃腸道環(huán)境中存活,具有抑菌活性、粘附能力、抗粘附及抗侵染的能力和免疫調(diào)節(jié)性能。這些結(jié)果表明工程乳酸菌株L.casei P4-cIL-10能作為益生菌的候選菌株。綜上所述,本課題初步豐富了乳酸菌體外篩選的指標(biāo),并通過體內(nèi)驗(yàn)證了乳酸菌的免疫調(diào)節(jié)活性在篩菌過程中的重要性。初步探索了工程乳酸菌在家禽中的應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31
，

本文編號(hào)：1267534