發(fā)布時(shí)間：2017-12-08 21:06

  本文關(guān)鍵詞：家蠶染色體構(gòu)象及其對(duì)絲素蛋白表達(dá)調(diào)控的研究

  更多相關(guān)文章： 家蠶 染色體構(gòu)象 Fib-H基因表達(dá) CRISPR/Cas9 核纖層蛋白

【摘要】：昆蟲(chóng)泌絲是我們生活中非常常見(jiàn)的現(xiàn)象,如蜘蛛結(jié)網(wǎng),昆蟲(chóng)結(jié)繭,蜜蜂筑巢等泌絲行為都具有獨(dú)特的生物學(xué)意義。但在眾多的泌絲昆蟲(chóng)中,家蠶經(jīng)進(jìn)化獲得了強(qiáng)大產(chǎn)絲能力,加上4000多年的人工馴化,使家蠶成為迄今為止吐絲能力最強(qiáng)的昆蟲(chóng)之一。家蠶一生食下20g桑葉,其絲腺可分泌0.5g繭絲。絲蛋白主要由三種絲素蛋白和三種絲膠蛋白組成,其中含量最高的絲素重鏈蛋白Fib-H占總繭絲量的70%,所以一頭蠶可以合成并分泌0.35g的絲素重鏈蛋白。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),Fib-H基因m RNA占總m RNA的19.3-54.5%。一個(gè)基因的表達(dá)量如此之高在自然界中也是非常罕見(jiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控Fib-H基因表達(dá)的兩種可能的機(jī)制:后部絲腺細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制形成超級(jí)多倍體細(xì)胞;多種轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控其精細(xì)的時(shí)空特異性表達(dá)。但兩種因素并不能完全解釋絲蛋白的高量表達(dá),是否存在其他調(diào)控方式呢?早期日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)Fib-H基因表達(dá)和不表達(dá)時(shí)其基因區(qū)域染色體狀態(tài)不同。隨著基因組研究技術(shù)的發(fā)展和對(duì)染色體結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)水平的提高,染色體狀態(tài)不同是由染色體的空間結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的并參與了基因的表達(dá)調(diào)控。研究染色體的空間結(jié)構(gòu)的主要方法是染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)及其衍生技術(shù)。那么染色體的構(gòu)象是否參與Fib-H基因表達(dá)調(diào)控的問(wèn)題依然不清楚。本文利用染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)獲取家蠶全基因組染色體互作圖譜,并從染色體互作圖譜中分析Fib-H基因區(qū)域染色體構(gòu)象,推測(cè)基因組三維空間結(jié)構(gòu)對(duì)Fib-H基因表達(dá)調(diào)控的影響,并通過(guò)CRISPR/Cas9特異性編輯后部絲腺的核纖層蛋白基因破壞染色體構(gòu)象來(lái)研究染色體結(jié)構(gòu)變化對(duì)Fib-H蛋白表達(dá)的影響。取得的主要研究結(jié)果如下:1.獲得家蠶Bm E細(xì)胞系及不同時(shí)期絲腺組織的全基因組染色體互作圖譜與三維基因組模型利用基于高通量測(cè)序的染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)(Hi C)構(gòu)建文庫(kù),經(jīng)測(cè)序、分析得到了Bm E細(xì)胞系(Bm E)、4齡眠期后部絲腺(4M-PSG)、5齡3天中部絲腺中部(5L3-MMSG)、5齡3天中部絲腺后部(5L3-PMSG)、5齡3天后部絲腺(5L3-PSG)及預(yù)蛹1天后部絲腺(PP1-PSG)的全基因組染色體互作圖譜,結(jié)果顯示,細(xì)胞系和組織(絲腺)均表現(xiàn)為染色體內(nèi)的相互作用頻率高,染色體間的相互作用頻率低,說(shuō)明家蠶細(xì)胞的染色體傾向于分布在細(xì)胞核內(nèi)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域形成染色體疆域。染色體間的相互作用以反式互作圖譜形式展示。在Bm E細(xì)胞系的反式互作圖譜中,Chr5、Chr13、Chr22間互作頻率高,由于染色體間的互作圖譜中染色體之間的互作頻率間接反映染色體在細(xì)胞內(nèi)的空間分布,所以推測(cè)3條染色體在Bm E細(xì)胞群體細(xì)胞核中位于空間上相對(duì)較近的位置。5L3-PSG的Chr11與Chr14間的互作頻率高,4M-PSG無(wú)互作頻率較高的的染色體,5L3-MMSG和5L3-PMSG組織中的Chr8與Chr24有較高互作頻率,PP1-PSG的Chr7與Chr22,Ch4與Chr7間的互作頻率高,推測(cè)這些互作頻率高的染色體在空間上更加靠近。根據(jù)染色體構(gòu)象捕獲數(shù)據(jù)模擬出細(xì)胞內(nèi)基因組三維結(jié)構(gòu),主要有兩種形式:Bm E細(xì)胞系相對(duì)同質(zhì)化,染色體間互作頻率較高;絲腺組織相對(duì)異質(zhì)化,染色體內(nèi)互作頻率較高。2.家蠶染色體互作圖譜中的區(qū)室化(Compartment)與拓?fù)湎嚓P(guān)區(qū)域(Topologically associated domain,TAD)分析分析顯示染色體內(nèi)的互作是家蠶細(xì)胞內(nèi)最主要互作模式。染色體內(nèi)各位點(diǎn)之間的相互作用稱為順式相互作用,順式互作圖譜的主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是染色體區(qū)室(compartment)劃分的依據(jù),以染色體互作圖譜的形式展示。家蠶Bm E細(xì)胞及組織樣本的染色體互作圖譜顯示,家蠶基因組相互作用存在相對(duì)更小的染色體互作區(qū)域——染色體區(qū)室,而染色體區(qū)室具有細(xì)胞類型特異性并且與染色質(zhì)的開(kāi)放與封閉有關(guān)。家蠶Bm E細(xì)胞染色體區(qū)室較明顯,一般將染色體分為1-6個(gè)區(qū)室。組織樣品的染色體區(qū)室化更加復(fù)雜,主成分分析中第一特征向量并不能很好反映染色體區(qū)室,需要結(jié)合第二特征向量進(jìn)行分析,且各染色體之間的差異非常大。有些染色體只有一個(gè)染色體區(qū)室,說(shuō)明整條染色體均分布于這個(gè)區(qū)室,染色體狀態(tài)較為相近。而有些染色體可分成多個(gè)區(qū)室,說(shuō)明染色體的不同區(qū)段位不同的區(qū)室,染色體的狀態(tài)隨著區(qū)室的變化而變化。絲腺組織樣品間的染色體區(qū)室差別較大,由于不同時(shí)期及不同部位的絲腺細(xì)胞在功能上存在差異,所以染色體特異的區(qū)室為細(xì)胞在特定時(shí)空下實(shí)現(xiàn)其功能提供了必要的環(huán)境。如果兩種組織功能差異非常大,其染色體區(qū)室也會(huì)相應(yīng)的發(fā)生變化。染色體內(nèi)更小層級(jí)的功能性互作模式為T(mén)AD,TAD位點(diǎn)間相互作用頻率非常高,但TAD外的區(qū)域即使在線性距離上靠近,相互作用頻率也非常低。家蠶細(xì)胞與組織的TAD分析顯示,Bm E細(xì)胞系的TAD大小為100kb~1Mb,而組織樣品中既含有較小的TAD,也包含較大的TAD,分布范圍為0.1Mb~2Mb。這與TAD的功能性有關(guān),TAD為相互作用的基因提供微環(huán)境保證基因表達(dá)調(diào)控更加的精準(zhǔn),多在基因的增強(qiáng)子-啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控基因表達(dá)。較小的TAD負(fù)責(zé)執(zhí)行基因本底表達(dá),相對(duì)保守,而大的TAD實(shí)現(xiàn)基因的調(diào)控表達(dá),具有組織時(shí)期特異性。3.5齡3天后部絲腺中三條染色體具有特殊的互作模式根據(jù)全基因組染色體互作圖譜分析發(fā)現(xiàn)5L3-PSG的Chr11、Chr24和Chr25三條染色體內(nèi)的相互作用具有特殊的染色體互作模式,即一段區(qū)域?qū)⑷旧�體分成兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的互作頻率很高的染色體區(qū)域,而兩個(gè)區(qū)域之間的互作頻率很低。將Chr11分成兩部分的區(qū)域?yàn)镃hr11:4,100,000~4,300,000,此區(qū)域內(nèi)并未注釋到編碼基因;將Chr24分成兩部分的區(qū)域?yàn)镃hr24:14,600,000~15,000,000,家蠶基因組精細(xì)圖譜中為gap區(qū);Chr25的間隔區(qū)域?yàn)镃hr25:11,700,000~11,900,000,此區(qū)域內(nèi)只有Fib-H基因。分析發(fā)現(xiàn)編碼三個(gè)絲膠蛋白的基因均位于Chr11,Sericin1位于較小的染色體互作區(qū)域,而Sericin2、sericin3位于較大的另一區(qū)域。Chr24不含有絲蛋白基因所以并未深入分析。絲膠蛋白基因與絲素蛋白基因在家蠶中超高量表達(dá)形成繭殼,兩類蛋白占繭殼總量的75%。染色體內(nèi)特殊的互作模式是否參與調(diào)控絲蛋白基因的高量表達(dá),目前仍不清楚。為了鑒定染色體的結(jié)構(gòu)與絲蛋白高量表達(dá)之間的關(guān)系,本研究分析了不同時(shí)期與部位的絲腺組織材料(4M-PSG、5L3-MMSG、5L3-PMSG、PP1-PSG)的染色體相互作用,結(jié)果顯示所有樣品中Chr11均出現(xiàn)特殊的染色體結(jié)構(gòu),而Chr25號(hào)染色體僅在5L3-PSG樣品中表現(xiàn)出特殊的染色體互作模式。5L3-MMSG與5L3-PMSG其它染色體間相互作用基本一致,4M-PSG與5L3-PSG中其它染色體間相互作用相近。雖然PP1-PSG為后部絲腺材料,因絲蛋白表達(dá)已經(jīng)結(jié)束并進(jìn)入預(yù)蛹期準(zhǔn)備化蛹,其染色體結(jié)構(gòu)與其它4個(gè)樣品差異較大,說(shuō)明染色體的結(jié)構(gòu)與功能的一致性。5個(gè)組織樣品中Chr25的差異較大,且分隔區(qū)域?yàn)镕ib-H基因,兩者之間主要表現(xiàn)在Fib-H基因的表達(dá)活性上。Fib-H基因在5L3-PSG中具有表達(dá)活性,在4M-PSG中暫時(shí)無(wú)表達(dá)活性,在PP1-PSG中失去表達(dá)活性,在5L3-MMSG、5L3-PMSG中永久性無(wú)表達(dá)活性。Chr25特殊互作模式的出現(xiàn)與Fib-H基因高量表達(dá)均具有組織時(shí)期特異性。此結(jié)果與1993年Waga等檢測(cè)4眠與5齡期后部絲腺以及5齡中部絲腺時(shí)發(fā)現(xiàn)Fib-H基因區(qū)域的5’上游、增強(qiáng)子-啟動(dòng)子區(qū)域和主要的蛋白編碼區(qū)域的DNase I敏感性具有明顯差異,即染色體結(jié)構(gòu)差異的結(jié)果一致[1]。推測(cè)Chr25染色體相互作用模式的差異暗示著這可能參與Fib-H基因的表達(dá)調(diào)控。相比Chr25的差異,Chr11在所有樣品中均表現(xiàn)出特殊的染色體互作模式。分析發(fā)現(xiàn)5個(gè)樣品存在細(xì)微的差異,僅在5L3-MMSG、5L3-PMSG中三個(gè)絲膠蛋白基因位點(diǎn)之間存在明顯的相互作用。所以推測(cè)Chr11的特殊染色體互作模式不具有組織時(shí)期特異性,但絲膠蛋白基因之間的染色體互作具有組織特異性。4.利用CRISPR/Cas9技術(shù)初步探索3D基因組結(jié)構(gòu)對(duì)絲腺中基因表達(dá)的影響Chr25在5齡3天后部絲腺中的特殊染色體構(gòu)象是否對(duì)Fib-H基因表達(dá)起調(diào)控作用仍不清楚。因此本研究通過(guò)基因編輯改變維持染色體構(gòu)象的方法,研究其對(duì)Fib-H基因表達(dá)的影響。核纖層蛋白在細(xì)胞核形態(tài)維持與核內(nèi)染色體分布的過(guò)程中起著重要作用,核纖層蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)染色體分布的紊亂從而改變細(xì)胞核內(nèi)基因組三維空間上的互作。核纖層蛋白在多個(gè)物種中高度保守,參考家蠶全長(zhǎng)c DNA文庫(kù)中鑒定的lamin C-like的序列[2],經(jīng)TA克隆測(cè)序驗(yàn)證開(kāi)放閱讀框(ORF),它與文庫(kù)中的序列一致,將lamin C-like基因命名為Bmlamin A/C。鑒定的Bmlamin A/C基因全長(zhǎng)為15111bp,包含10個(gè)外顯子與9個(gè)內(nèi)含子,m RNA全長(zhǎng)3262bp,ORF編碼620個(gè)氨基酸,含有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。定量PCR檢測(cè)Bmlamin A/C基因的組織達(dá)譜,結(jié)果顯示Bmlamin A/C基因在5齡3天的頭部、脂肪體、馬氏管、中腸、絲腺及生殖腺組織中均有表達(dá)。近年來(lái)本實(shí)驗(yàn)室先后采用ZFN、TALEN與CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了家蠶基因編輯,三種方法均通過(guò)胚胎注射瞬時(shí)表達(dá)的人工核酸酶的m RNA或質(zhì)粒,篩選可遺傳的突變后代獲取轉(zhuǎn)基因個(gè)體。瞬時(shí)編輯方法對(duì)胚胎致死基因或發(fā)育調(diào)控基因的編輯存在較大限制。而B(niǎo)mlamin A/C基因編碼重要的結(jié)構(gòu)蛋白,全身敲除會(huì)嚴(yán)重影響家蠶生長(zhǎng)發(fā)育,無(wú)法研究染色體結(jié)構(gòu)變化對(duì)絲蛋白合成的影響,所以需要構(gòu)建組織特異性基因編輯系統(tǒng)。本研究首先構(gòu)建了高效靶位點(diǎn)篩選系統(tǒng),利用此系統(tǒng)確定靶位點(diǎn)的突變效率,篩選用于個(gè)體基因編輯的高效率位點(diǎn)。隨后分別構(gòu)建在后部絲腺特異性表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因家蠶,全身性表達(dá)靶向g RNA的轉(zhuǎn)基因品系,雜交后篩選轉(zhuǎn)基因標(biāo)記,得到組織特異的靶基因編輯突變個(gè)體。根據(jù)上述策略得到了后部絲腺特異性表達(dá)Cas9轉(zhuǎn)基因品系以及全身性表達(dá)靶向編輯Bmlamin A/C基因的g RNA轉(zhuǎn)基因品系,雜交后共獲得2個(gè)后部絲腺特異靶向編輯Bmlamin A/C基因的轉(zhuǎn)基因系。檢測(cè)顯示基因組水平上Bmlamin A/C基因靶位點(diǎn)100%突變,m RNA下調(diào)43.7%-74.3%,蛋白表達(dá)量下降了83%-91%。2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中Bm Lamin A/C蛋白的表達(dá)量下調(diào),絲蛋白合成能力均受到影響,繭層率顯著下降,其中一個(gè)品種有部分幼蟲(chóng)甚至不能吐絲結(jié)繭。轉(zhuǎn)基因個(gè)體中后部絲腺細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯變化,但絲腺細(xì)胞排列紊亂,絲腺變短,絲腺腔變大中空,表型與Fib-H基因敲除(本實(shí)驗(yàn)室前期研究)的轉(zhuǎn)基因個(gè)體相似。熒光定量PCR結(jié)果顯示后部絲腺中主要絲素蛋白基因表達(dá)量下調(diào)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,Fib-H基因表達(dá)量從總TPM值的20%下降到10%,表明突變體中基因組結(jié)構(gòu)的變化對(duì)Fib-H基因的影響最大。根據(jù)以上結(jié)果推斷染色體的三維結(jié)構(gòu)調(diào)控Fib H基因的表達(dá)。綜合以上研究結(jié)果,本研究利用Hi C染色體構(gòu)象捕獲方法獲得家蠶細(xì)胞及組織的全基因組染色體互作圖譜,并對(duì)染色體構(gòu)象參與絲蛋白表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了初步的分析。結(jié)果顯示,Chr25特殊的染色體互作模式的出現(xiàn)與Fib-H基因的表達(dá)均具有組織時(shí)期特異性,暗示前者對(duì)后者存在調(diào)控作用;利用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)后部絲腺染色體結(jié)構(gòu)的擾亂,絲蛋白的表達(dá)量明顯下調(diào),表明染色體的構(gòu)象可能是一種新的調(diào)控絲蛋白高量表達(dá)的因素。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S881.2

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 孫國(guó)鳳;;切割染色體基因的自動(dòng)裝置[J];生物技術(shù)通報(bào);1991年02期

2 任兆鈞,馮淇輝,劉新垣;羊生長(zhǎng)激素染色體基因的分離及結(jié)構(gòu)分析[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1988年03期

3 侯貴盛,蘇國(guó)富,趙國(guó)力,孫健,茍仕金;禽多殺性巴氏桿菌C_(48—1)染色體基因文庫(kù)的構(gòu)建[J];中國(guó)獸醫(yī)科技;1988年04期

4 李艷紅;董文甫;李艷軍;張桂賢;郭傳甲;;染色體技術(shù)研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2006年09期

5 薛慧玲;張?jiān)品?陳祈磊;趙海;李紅梅;;浮萍形態(tài)分類鑒定與染色體觀察[J];北方園藝;2014年16期

6 劉興漢;;布氏桿菌M28株染色體基因庫(kù)的建立[J];中國(guó)畜禽傳染病;1991年01期

7 王朝元，湯伏生，，龍華;鰱、鳙染色體基因文庫(kù)的構(gòu)建[J];淡水漁業(yè);1995年03期

8 饒友生;梁菲菲;王樟鳳;柴學(xué)文;張細(xì)權(quán);;雞Z染色體基因表達(dá)的密碼子偏性[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 楊陟華;陸穎;曹珍山;朱茂祥;;貧鈾誘發(fā)人類11號(hào)染色體基因突變研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)分會(huì)第三次全國(guó)中青年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2001年

2 周鵬;陳剛;榮海欽;季虹;劉文敏;魏然;楊樹(shù)林;欒萌;劉陽(yáng);高春義;;山東省2型糖尿病2號(hào)染色體基因掃描研究[A];山東生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 楊陟華;陸穎;曹珍山;;貧鈾誘發(fā)人類11號(hào)染色體基因突變研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)分會(huì)第三次全中國(guó)青年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2001年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 奇 云;Ｙ染色體活躍 男性還將滅絕嗎[N];大眾科技報(bào);2003年

2 王俊鳴;科學(xué)家破譯人類第2、4號(hào)染色體基因序列[N];科技日?qǐng)?bào);2005年

3 張?zhí)锟?第21號(hào)染色體的秘密[N];大眾科技報(bào);2000年

4 奇 云;人類第６號(hào)染色體有何秘密[N];大眾科技報(bào);2003年

5 記者 鄭曉春;第20對(duì)染色體基因測(cè)序完成[N];科技日?qǐng)?bào);2001年

6 記者　曹麗君;科學(xué)家公布人類X染色體基因序列草圖[N];光明日?qǐng)?bào);2005年

7 張揆一;女性長(zhǎng)壽新說(shuō)[N];云南科技報(bào);2001年

8 本報(bào)記者 湯江峰;X染色體“作怪”世人千姿百態(tài)[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2005年

9 記者 鄭曉春;人類第20對(duì)染色體基因測(cè)序完成[N];科技日?qǐng)?bào);2001年

10 奇云;X染色體揭示男女差異生物學(xué)隱秘[N];大眾科技報(bào);2005年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 劉園園;家蠶染色體構(gòu)象及其對(duì)絲素蛋白表達(dá)調(diào)控的研究[D];西南大學(xué);2017年

2 蔣永華;兔雌性胚胎干細(xì)胞X染色體活性狀態(tài)的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 羅霄;基于多染色體基因表達(dá)式編程的可逆邏輯綜合方法研究[D];東華大學(xué);2017年

2 趙玉霞;Klinefelter綜合征表達(dá)譜與DNA甲基化改變[D];天津醫(yī)科大學(xué);2012年

3 周洋;兩例染色體拷貝數(shù)異�；颊叩呐R床及細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究[D];南京師范大學(xué);2013年

4 汪春云;家蠶Z染色體基因的劑量分析[D];西南大學(xué);2008年

5 解廷月;果蠅基因組中幾類序列的序列信息參數(shù)沿染色體的分布[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2006年

6 孫娟娟;Ki-67,CK20,p53,CyclinD1蛋白以及3、7、17號(hào)染色體和9p21在膀胱腫瘤中的檢測(cè)及意義的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

7 蔣婷婷;漢族人群冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病8和11號(hào)染色體易感基因位點(diǎn)掃描研究[D];山東大學(xué);2013年

本文編號(hào)：1267823