發(fā)布時(shí)間：2017-12-09 17:26

  本文關(guān)鍵詞：PA基因影響流感病毒哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和致病性的機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 流感病毒 PA蛋白 PA-X蛋白 反向遺傳操作技術(shù) 致病機(jī)制

【摘要】：動(dòng)物流感病毒不僅持續(xù)危害畜牧業(yè),給畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,而且可以跨越種間障礙感染人群,給公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此,解析影響流感病毒在哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和致病性的分子機(jī)制,對(duì)流感的防控具有重要意義。PA基因是A型流感病毒基因組的八個(gè)基因節(jié)段之一,研究表明,PA基因所編碼的病毒蛋白與流感病毒的宿主特異性和適應(yīng)性密切相關(guān),但PA蛋白哪些氨基酸位點(diǎn)的突變而導(dǎo)致病毒的適應(yīng)性以及致病性的改變尚未完全解析。本研究通過(guò)對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新型基因重組H7N9和H10N8病毒的PA蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),隨著時(shí)間的推移,H9N2禽流感病毒的PA-356R逐漸取代PA-356K成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)流行。而且,2013年在我國(guó)首次爆發(fā)感染人的新型重組H7N9和H1ON8病毒也都主要表現(xiàn)為PA-356R,而該新型重組H7N9和H10N8病毒的PA基因恰來(lái)源于H9N2AIV。PB2-627K已被廣泛證明與AIV適應(yīng)哺乳動(dòng)物密切相關(guān),我們發(fā)現(xiàn),與禽源H7N9和H10N8病毒相比,感染人群的H7N9和H10N8病毒普遍出現(xiàn)PA-356R和PB2-627K共存在的現(xiàn)象。因此,我們推測(cè)AIV可能通過(guò)PA-356R單獨(dú)或協(xié)同PB2-627K發(fā)揮作用,增強(qiáng)病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性和致病性,最終促進(jìn)了新型重組H7N9和H10N8病毒在人群的爆發(fā)。為驗(yàn)證PA-K356R突變?cè)鰪?qiáng)AIV在哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性和致病性這一推測(cè),我們以一株H9N2病毒(A/chicken/Hebei/LC/2008)作為骨架,利用定點(diǎn)突變技術(shù)和反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了PA-K356R單突變、PB2-E627K單突變以及PA-K356R和PB2-E627K雙突變的三株重組病毒,并評(píng)價(jià)這些重組病毒在哺乳動(dòng)物體內(nèi)和體外的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示,PA-K356R突變顯著增強(qiáng)H9N2病毒PA蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上的核輸入效率,聚合酶活性及基因組轉(zhuǎn)錄與復(fù)制能力研究結(jié)果表明,PA-K356R或PB2-E627K單突變可顯著增強(qiáng)H9N2病毒的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系上的聚合酶活性,以及病毒mRNA與vRNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制能力,而且PA-K356R和PB2-E627K同時(shí)存在時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同增強(qiáng)的效果。在體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和小鼠體內(nèi)感染性研究結(jié)果表明,PA-K356R或PB2-E627K單突變可以增強(qiáng)病毒體外和體內(nèi)的復(fù)制力,以及增強(qiáng)病毒在小鼠的致病性,并誘導(dǎo)了在小鼠高水平的促炎／炎性細(xì)胞因子表達(dá),且PA-K356R和PB2-E627K雙突變表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。因此,PA-K356R突變?cè)鰪?qiáng)AIV在哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性和致病性。最近研究發(fā)現(xiàn),PA基因不僅編碼PA蛋白,而且還編碼PA-X蛋白。PA-X蛋白對(duì)豬流感病毒生物學(xué)特性的影響尚不清楚。為解析PA-X蛋白對(duì)豬源流感病毒生物學(xué)特性的影響,我們以H1N2豬流感病毒(SIV, A/swine/Guangdong/1222/2006)為骨架,利用定點(diǎn)突變技術(shù)和反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了PA-X蛋白缺失的重組H1N2SIV,并評(píng)價(jià)這些重組病毒在體外培養(yǎng)豬源細(xì)胞和豬體內(nèi)的生物學(xué)特性。體外研究結(jié)果顯示,PA-X蛋白缺失后的重組H1N2 SIV在體外培養(yǎng)豬源細(xì)胞系和豬呼吸系統(tǒng)組織上的生長(zhǎng)復(fù)制能力都顯著減弱。體內(nèi)研究結(jié)果表明,PA-X蛋白缺失后,H1N2SIV在豬體內(nèi)的復(fù)制力和致病性也顯著降低,且在豬群之間的傳播性顯著減弱。進(jìn)一步的研究表明,豬流感病毒可通過(guò)PA-X的“宿主關(guān)閉”功能抑制宿主細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答,降低了宿主的抗病毒能力,從而有利于病毒在感染宿主的生長(zhǎng)復(fù)制。序列分析表明,PA-X蛋白的X-ORF存在兩種長(zhǎng)度：全長(zhǎng)形式的61個(gè)氨基酸和截短形式的41個(gè)氨基酸。進(jìn)一步對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中所有SIV的PA-X蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),自從1930年首次在豬群中分離到SIV至1985年,所有SIV的PA-X的X-ORF均表現(xiàn)為全長(zhǎng)形式,隨后出現(xiàn)X-ORF為截短形式的PA-X,而且隨著時(shí)間推移,編碼截短形式PA-X的SIV逐漸取代編碼全長(zhǎng)形式PA-X的SIV,并在豬群中趨于優(yōu)勢(shì)流行,截止到2014年,95%的SIV編碼截短形式的PA-X蛋白。因此我們提出假設(shè)：截短形式的PA-X可能有助于增強(qiáng)SIV在豬群中的適應(yīng)性?為驗(yàn)證截短形式的PA-X蛋白可能有助于增強(qiáng)SIV在豬群中的適應(yīng)性這一假設(shè),我們以一株編碼截短形式PA-X的H1N2 SIV (A/swine/Guangdong/1222/2006)為骨架,構(gòu)建了一株編碼全長(zhǎng)形式PA-X的重組病毒,并評(píng)價(jià)PA-X蛋白長(zhǎng)度對(duì)這兩株SIV體外和體內(nèi)生物學(xué)特性的影響。研究結(jié)果顯示,截短PA-X的SIV在體外培養(yǎng)豬源細(xì)胞系和豬呼吸系統(tǒng)組織上的復(fù)制能力顯著強(qiáng)于編碼全長(zhǎng)形式PA-X的SIV。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,截短形式PA-X有助于增強(qiáng)SIV在豬的復(fù)制力、致病性和傳播性。進(jìn)一步的研究表明,無(wú)論在感染豬體內(nèi)還是體外細(xì)胞系,與全長(zhǎng)形式的PA-X蛋白相比,截短的PA-X都擁有更強(qiáng)的抑制IFN表達(dá)的能力,從而降低宿主的抗病毒能力。綜上所述,本研究揭示了PA-K356R可以增強(qiáng)AIV在哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性和致病性,并初步解析了其增強(qiáng)AIV在哺乳動(dòng)物適應(yīng)性和致病性的分子機(jī)制。證明了PA-X蛋白具有抑制免疫應(yīng)答的功能,從而有利于增強(qiáng)H1N2 SIV在豬中的適應(yīng)性和致病性。而且,與全長(zhǎng)PA-X相比,截短PA-X可進(jìn)一步促進(jìn)SIV在豬群中的適應(yīng)性和致病性。本研究為動(dòng)物源流感病毒在哺乳動(dòng)物流行潛力評(píng)估和防控提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
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本文編號(hào)：1271245