發(fā)布時間：2017-12-09 22:03

  本文關(guān)鍵詞：甘藍型油菜細胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析

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【摘要】：甘藍型油菜細胞核雄性不育系Rs1046A和FM195A是從Yi3A轉(zhuǎn)育而來的顯性核不育系。前人的遺傳分析研究顯示,該不育系統(tǒng)的育性受到同一位點的三個復(fù)等位基因控制,這3個復(fù)等位基因分別為Bn MS5a(恢復(fù)基因),BnMS5b(不育基因)和BnMS5c(正常可育或臨保系基因),且3個等位基因之間的顯隱性關(guān)系為BnMS5aBnMS5bBnMS5c。為了闡明顯性核不育的機制,我們通過圖位克隆的方法獲得了育性調(diào)控基因BnMS5。之后,對Bn MS5的表達模式、起源進化和不同等位基因的功能分化進行了詳細的分析。結(jié)合細胞生物學和分子生物學方法研究顯示,BnMS5a可能通過調(diào)節(jié)減數(shù)分裂染色體的濃縮使染色體維持正常的結(jié)構(gòu),從而保證減數(shù)分裂的順利完成。主要研究結(jié)果如下:1.恢復(fù)基因BnMS5a的克隆通過篩選一個包含目的等位基因BnMS5a和BnMS5b的BAC文庫,獲得了BnMS5位點的物理圖譜。結(jié)合之前研究獲得的包含BnMS5c區(qū)段的序列,根據(jù)甘藍型油菜參考基因組信息,對標記BE10和SCD8間的序列進行注釋,比對不同等位基因的序列信息,選擇其中一個在三個復(fù)等位基因中序列均有差異的基因作為候選基因。通過遺傳轉(zhuǎn)化實驗確定來自于恢復(fù)系中的BnaA08g25920D可以恢復(fù)不育系的育性,即為目的等位基因BnMS5a。2.BnMS5等位基因的序列分析三個復(fù)等位基因的序列比對分析顯示,BnMS5a和BnMS5c在編碼區(qū)序列差異較小,僅有18個氨基酸的差異,但啟動子區(qū)序列一致性僅為56.1%,差異極大。BnMS5b則為BnMS5a在第二個內(nèi)含子區(qū)內(nèi)MULE類轉(zhuǎn)座子插入造成的功能缺失突變。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn),BnMS5編碼一個功能未知的十字花科蕓薹屬特異蛋白,其N端有一個預(yù)測的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域,C端為一個DUF626結(jié)構(gòu)域。3.顯性核不育材料FM195A的染色體形態(tài)觀察染色體展片結(jié)果觀察FM195A減數(shù)分裂各時期染色體的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn),細線期后染色體的形態(tài)開始異常,染色體不能正常凝集而是相互靠近形成緊實的一團,減數(shù)分裂過程在細線期到偶線期的轉(zhuǎn)換過程中停滯。4.BnMS5在減數(shù)分裂過程中的功能研究45S、5SrDNA和pAtT4探針熒光原位雜交檢測結(jié)果顯示,FM195A中同源染色體在減數(shù)分裂偶線期不能正常配對,沒有觀察到端粒的花束狀結(jié)構(gòu)。免疫熒光實驗顯示,FM195A中γH2AX信號與FM195B基本相同,表明DSB可正常形成;減數(shù)分裂染色體軸向元件關(guān)聯(lián)蛋白ASY1可正常定位到FM195A染色體上,說明減數(shù)分裂前期I早期染色體蛋白軸的組裝過程基本正常。而黏著蛋白(cohesin蛋白)SYN1及聯(lián)會復(fù)合體中央元件重要組分ZYP1的定位受到嚴重影響,表明MS5是減數(shù)分裂特異的聯(lián)會復(fù)合體組裝所必需的;同時,HEI10信號也沒有定位到突變體染色體上,表明MS5也是減數(shù)分裂同源重組所需的。5.BnMS5的表達分析qRT-PCR結(jié)果顯示,BnMS5a和BnMS5c在油菜花蕾,莖和葉中均有表達。利用RNA原位雜交和GUS染色技術(shù),我們檢測了BnMS5a在油菜花藥發(fā)育各個時期以及擬南芥各個組織中的表達狀況。RNA原位雜交檢測結(jié)果顯示,BnMS5a在花粉母細胞時期花藥壁以及小孢子母細胞中可檢測到信號。GUS染色結(jié)果表明,BnMS5a在擬南芥各個組織中均有表達,其在花藥中的表達模式與原位雜交的結(jié)果基本一致。BnMS5b由于在第二個內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)座子的插入,使得基因的表達量顯著下降,RNA剪切異常,可以確定,BnMS5b是一個功能缺失基因型。轉(zhuǎn)錄和蛋白表達分析顯示,MS5a的表達量最高,MS5c次之,MS5b最低。6.BnMS5基因的起源和進化分析分離白菜、甘藍和甘藍型油菜中的同源基因發(fā)現(xiàn),在油菜中除BnMS5外,還有兩個同源基因:BnMS5-COPY2和BnMS5-COPY3。進化樹和序列一致性分析表明BnMS5的兩個有功能的等位基因BnMS5a和BnMS5c來源于白菜,而兩個同源基因則來源于甘藍。該基因只在蕓薹屬特異存在,是一個進化上新近產(chǎn)生的蕓薹屬特異的孤兒基因。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4
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本文編號：1271990