發(fā)布時間：2017-12-09 22:16

  本文關(guān)鍵詞：番茄潰瘍病菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)、復(fù)蘇及機制研究

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【摘要】：番茄潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)是我國重要的檢疫性有害生物,引起的細(xì)菌性潰瘍病嚴(yán)重影響番茄制種業(yè)和大田生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。本論文根據(jù)細(xì)菌受逆境脅迫可進入“有活力但不可培養(yǎng)”(Viable but nonculturable, VBNC)狀態(tài)的理論,設(shè)計了與番茄生產(chǎn)中使用銅制劑防治細(xì)菌病害、種子收獲過程中使用酸處理等相關(guān)的對病原菌構(gòu)成逆境脅迫的條件,系統(tǒng)研究了番茄潰瘍病菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)及復(fù)蘇條件,并通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量PCR的方法,對番茄潰瘍病菌VBNC狀態(tài)的機制進行了探索,期望為解析番茄潰瘍病菌在逆境條件下的生存策略及進一步探明田間病害的初侵染來源提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下：1)建立了基于SYTO 9/碘化丙啶(PI)染色的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合平板計數(shù)的方法,應(yīng)用于VBNC狀態(tài)Cmm的檢測和計數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)對Cmm的最佳計數(shù)范圍為105-107 cell/ml;選用SYTO 9對Cmm進行染色,染料終濃度為50 μM,染色時間為30 min,檢測通道為FL1,電壓為640 V；選用P1對Cmm死菌進行染色,染料終濃度為150μM,染色時間為60 min,檢測通道為FL2,電壓為625 V；流式細(xì)胞儀的FSC電壓模式為E00, SSC電壓為440 V,放大模式為Log型,進樣速度為中速,激發(fā)光波長為488 nm。2)證實了Cmm在寡營養(yǎng)的條件下,受低濃度銅離子和溫和的酸性條件誘導(dǎo)可加速進入VBNC狀態(tài)。在含有0.05 μM、0.5μM、5 μM和50.00 μM硫酸銅的0.85%氯化鈉溶液中,Cmm分別在誘導(dǎo)37 d、1 d、1 d和2h后,有活力的菌體全部進入VBNC狀態(tài)；在pH3.5、pH4.5和pH 5.5的0.85%氯化鈉溶液中,Cmm分別在誘導(dǎo)3 d、35 d和107 d后,有活力的菌體全部進入VBNC狀態(tài)；在不添加銅離子且pH為中性的0.85%氯化鈉溶液中,有活力的Cmm在約110 d后方可全部進入VBNC狀態(tài)。在試驗范圍內(nèi)銅離子濃度越高或pH值越低,Cmmm進入VBNC狀態(tài)的速度越快。3) VBNC狀態(tài)的Cmm可通過去除體系中的誘導(dǎo)因素、添加營養(yǎng)物質(zhì)或?qū)⑵浣臃N到寄主植株等方法進行復(fù)蘇,恢復(fù)可培養(yǎng)性,菌體在復(fù)蘇后致病力得到恢復(fù)。在VBNC誘導(dǎo)體系中添加終濃度為誘導(dǎo)使用銅離子濃度1.5倍的EDTA,可以使50州銅離子誘導(dǎo)2 h、5μM銅離子誘導(dǎo)8h和1d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇；添加0.1×LB液體培養(yǎng)基可以使50 pM和5μM銅離子誘導(dǎo)1 d以及pH 3.5誘導(dǎo)11 d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇；添加5%的番茄幼苗勻漿培養(yǎng)基可以使5μM銅離子誘導(dǎo)1d和5d以及pH 3.5誘導(dǎo)11d的VBNC狀態(tài)Cmmm復(fù)蘇。Cmm的LB培養(yǎng)液的上清液可以使50μM銅離子誘導(dǎo)1d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇；接種寄主番茄幼苗的方法可以使50μM銅離子誘導(dǎo)2 h、1 d、2 d、3 d,5μM銅離子誘導(dǎo)1d,以及0.5 pM銅離子誘導(dǎo)4d的VBNC狀態(tài)Cmm復(fù)蘇。上述復(fù)蘇后得到的菌體接種番茄幼苗后,均具有致病性。4)利用RNA-Seq技術(shù)研究了Cmm形成及維持VBNC狀態(tài)的機制,通過qPCR對sigH等16個關(guān)鍵基因進行了驗證,并利用突變體初步探索了sigH和katA在VBNC狀態(tài)Cmm中的功能。受銅離子脅迫5min-10d后,Cmm中有114個基因表達量顯著上調(diào),38個基因表達量顯著下調(diào)。Cmm在銅離子脅迫下進入并維持VBNC狀態(tài)的過程涉及到龐大的調(diào)控網(wǎng)路,σ因子(sigH)及MarR等與重金屬脅迫相關(guān)蛋白家族起到了重要的調(diào)控作用,抗銅基因(如CMM_1035、 CMM_1037)、壓力脅迫相關(guān)基因(如CMM 0581、CMM_0737)、嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)基因(如CMM_1809、CMM_465)等眾多基因行使重要功能,細(xì)胞壁形成相關(guān)的多個基因(如CMM_2638)表達水平發(fā)生顯著變化,雖有較活躍的能量和物質(zhì)代謝,但細(xì)胞分裂相關(guān)基因(如CMM_0842、CMM_0012)受到抑制,細(xì)菌可維持活性但失去可培養(yǎng)性。katA的敲除使Cmm生長速率變慢,但對銅離子脅迫的反應(yīng)與親本菌株無顯著差異；sigH的敲除使Cmm進入穩(wěn)定期的時間延遲,對銅離子脅迫更敏感,推測sigH在Cmm的VBNC狀態(tài)形成中起到了重要作用。本論文首次針對革蘭氏陽性植物病原細(xì)菌開展VBNC的相關(guān)研究,并率先對植物病原細(xì)菌VBNC狀態(tài)的機制進行了探索,研究結(jié)果對于豐富植物病原細(xì)菌生理學(xué)的理論體系,探明VBNC狀態(tài)細(xì)菌作為田間番茄潰瘍病可能的初侵染來源、改進檢疫性植物病原細(xì)菌檢測方法和病害綜合治理具有重要的參考價值。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.412

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本文編號：1272050