發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 01:25

  本文關(guān)鍵詞：黃瓜綠斑駁花葉病毒與甘蔗花葉病毒基因組測(cè)序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析

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【摘要】：黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV)和甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)是農(nóng)作物上的兩種重要病毒,其分布范圍廣,危害重,給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。本論文主要圍繞CGMMV 和 SCMV兩個(gè)病毒的基因組測(cè)序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、SCMV單克隆抗體制備及其應(yīng)用等開展相關(guān)研究,取得如下研究結(jié)果：1、7個(gè)CGMMV浙江分離物基因組測(cè)序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析利用以CGMMV單抗為核心建立的dot-ELISA方法對(duì)采自浙江省不同地方的762份葫蘆科作物、4批葫蘆科作物種子及60份雜草樣品進(jìn)行CGMMV普查。結(jié)果顯示,葫蘆植株及其種子、西瓜植株及其嫁接苗、甜瓜植株等樣品中均檢測(cè)到CGMMV。另外,在田間雜草碎米芥和空心蓮子草中檢測(cè)到CGMMV的存在,這是CGMMV感染雜草的首次報(bào)道。根據(jù)CGMMV在浙江省的地理分布及不同作物上的發(fā)生情況,從中選取感染CGMMV的4株西瓜植株、2株西瓜嫁接苗和1株甜瓜植株樣品進(jìn)行病毒全基因組克隆和測(cè)序,獲得了7個(gè)CGMMV浙江分離物全基因組序列。測(cè)序結(jié)果表明,CGMMV臺(tái)州西瓜分離物和建德西瓜分離物的全基因組序列長(zhǎng)度分別為6425 bp和6423 bp,2個(gè)東陽西瓜分離物全基因組序列長(zhǎng)度分別為6423 bp和6425 bp,蕭山西瓜嫁接苗和東陽西瓜嫁接苗分離物全基因組序列長(zhǎng)度分別為6423 bp和6424 bp,CGMMV建德甜瓜分離物全基因組序列長(zhǎng)度為6423 bp。同源性分析發(fā)現(xiàn)這7個(gè)分離物全基因組核苷酸同源性在99.2～100%之間。結(jié)合GenBank登錄的24個(gè)CGMMV分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,除分離物Ec外,其它分離物根據(jù)地理來源的不同分為兩組,即亞洲分離物聚在組I,歐洲分離物聚在組II,表明CGMMV的種群分化極有可能受地理分布的影響。CGMMV全基因組核苷酸序列位點(diǎn)變異分析發(fā)現(xiàn),其各個(gè)位點(diǎn)的變異率均在8%以下,大多集中在2-5%之間,表明CGMMV基因組較保守、變異較少。CGMMV堿基替換突變類型分析顯示,其具有轉(zhuǎn)換(AHG和CHT)明顯強(qiáng)于顛換(A←→C、A←→T、G←→C 和 G←→T)的偏好性。發(fā)生在CGMMV基因組上的大多數(shù)變異均導(dǎo)致了非同義突變的產(chǎn)生,且由于堿基替換類型的強(qiáng)烈偏好性,一些氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)了高于30%的非同義替代率。選擇壓分析結(jié)果顯示,在復(fù)制相關(guān)蛋白186 kDa和129 kDa ORF中檢測(cè)到強(qiáng)烈的負(fù)向選擇壓,這與報(bào)道的發(fā)生在其它RNA病毒中的情況類似。最后,分離物Ec的重組分析發(fā)現(xiàn),在多個(gè)重組檢測(cè)中分離物Ec作為重組體的可信度均較低。2、SCMV云南分離物的基因組測(cè)序及種群遺傳結(jié)構(gòu)分析利用RT-PCR的方法檢測(cè)來自云南田間的1個(gè)玉米樣品,發(fā)現(xiàn)其感染SCMV。隨后進(jìn)行該分離物(命名為SCMV-YN)基因組克隆和測(cè)序,得到不含poly (A)長(zhǎng)9 598 bp的全基因組序列。這是SCMV云南玉米分離物在全基因組序列上的首次報(bào)道。基因組結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,SCMV-YN分離物的CI蛋白中典型的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域V1215LLLEPTRPL1224突變成了V1215LLIEPTRPL1224, NIb蛋白C末端的原核脂蛋白結(jié)構(gòu)域12554LAFNYTLLSC2564突變成I2554IAFNYAMLSS2564。與GenBank登錄的28個(gè)SCMV分離物全基因組核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),SCMV-YN與河北玉米分離物SCMV-BD8的同源性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它分離物,達(dá)到95.2%,且在這些分離物中,P1變異最大,CI和PIPO相比其它ORFs保守得多。基于全基因組核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示29個(gè)SCMV分離物被分為兩組,即組Ⅰ和組Ⅱ。且在兩大組內(nèi)部又各分為兩小組,分別為組Ⅰ A (Maize)、組Ⅰ B(Maize/Sugarcane)和組ⅡA (Maize/Sugarcane)、組ⅡB (Sugarcane)。且地理分布對(duì)分離物親緣關(guān)系的影響有所弱化,寄主來源對(duì)分離物親緣關(guān)系的影響依然存在。SCMV全基因組核苷酸位點(diǎn)變異分析發(fā)現(xiàn),其各個(gè)位點(diǎn)變異程度存在明顯波動(dòng),大多集中在15～20%之間,表明SCMV基因組存在高變異率。SCMV堿基替換突變類型與報(bào)道的其它RNA病毒類似,呈現(xiàn)轉(zhuǎn)換(AHG和CHT)明顯強(qiáng)于顛換(A←→C、A←→T、G←→C和G←→T)的偏好性。遺傳差異及基因流分析顯示,組I和組11分離物在所有ORFs中均存在顯著的遺傳差異；同時(shí)在P3、NIa-VPg、NIa-Pro 和 NIb-replicase等ORFs中檢測(cè)到頻繁的基因流。選擇壓分析顯示,SCMV分離物編碼的所有ORFs均處于負(fù)向(凈化)選擇壓下,且CI ORF受到的負(fù)向選擇壓最大。重組分析顯示,29個(gè)SCMV分離物中7個(gè)分離物檢測(cè)到明顯重組。且對(duì)這7個(gè)分離物的重組區(qū)域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),除P3 ORF外,其它區(qū)域均檢測(cè)到了重組。3、SCMV-YN分離物單抗的制備及其應(yīng)用用提純的SCMV-YN病毒粒子免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合、篩選與克隆成功獲得9株能分泌SCMV單抗的雜交瘤細(xì)胞株(6A1、6A12、10B11、12A10、15C12、19F3、21C12、21H3和22A2),并制備單抗腹水。9株單抗腹水的間接ELISA效價(jià)在10-6-10-7之間,抗體類型及亞類均為IgG1、kappa輕鏈。Western blot分析發(fā)現(xiàn),6A1、21H3和22A2這3個(gè)單抗對(duì)SCMV-YN和SCMV北京分離物均具有免疫反應(yīng),說明它識(shí)別的是這兩個(gè)分離物外殼蛋白亞基的共同抗原決定簇；而10B11、12A10、15C12、19F3和21C12這5個(gè)單抗僅對(duì)SCMV-YN分離物具有免疫反應(yīng),說明它識(shí)別的是SCMV-YN分離物外殼蛋白亞基的特異性抗原決定簇。6A12單抗在Western blot時(shí)不識(shí)別SCMV外殼蛋白等病毒結(jié)構(gòu)蛋白,結(jié)合其dot-ELISA結(jié)果推測(cè)該單抗識(shí)別的是針對(duì)構(gòu)象型的抗原決定簇。以制備的單抗為核心建立dot-ELISA檢測(cè)方法,并對(duì)其特性進(jìn)行分析。特異性分析顯示,6A1、21H3和22A2這3個(gè)單抗及以其為核心建立的dot-ELISA方法在檢測(cè)SCMV-YN和北京分離物時(shí)均呈陽性反應(yīng)；而6A12、10B11、12A10、15C12、19F3和21C12這6個(gè)單抗及以其為核心建立的dot-ELISA方法在檢測(cè)SCMV-YN和北京分離物時(shí),僅對(duì)SCMV-YN分離物呈陽性反應(yīng),這說明其可用于SCMV-YN分離物的株系鑒定和檢測(cè)。dot-ELISA方法分析單抗靈敏度顯示,6A1、15C12、10B11和21H3單抗對(duì)病葉的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到1：10 240倍稀釋(w/v,g/mL),12A10和19F3單抗的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到1：5 120倍稀釋(w/v,g/mL),21C12和22A2單抗的檢測(cè)靈敏度均達(dá)到1：2 560倍稀釋(w/v,g/mL),而6A12單抗的檢測(cè)靈敏度也到達(dá)1：1 280倍稀釋(w/v,g/mL)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S432.41
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本文編號(hào)：1272614