發(fā)布時間：2017-12-10 02:12

  本文關(guān)鍵詞：Viperin蛋白抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制及其分子機制

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)屬于套式病毒目,動脈炎病毒科,動脈炎病毒屬的有囊膜單股正鏈RNA病毒,基因組全長15kb左右,具有nsp1-nsp12 14個非結(jié)構(gòu)蛋白和9個結(jié)構(gòu)蛋白,能造成母豬懷孕后期流產(chǎn),產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等,引起仔豬、育肥豬呼吸道癥狀,死亡率升高。該病毒強烈抑制干擾素的產(chǎn)生,但外源IFNs對該病毒的復(fù)制具有強烈的抑制作用。Viperin屬于干擾素刺激基因,對多種病毒均具有抗病毒作用。本實驗擴增并克隆了豬和猴的Viperin基因,制備了該蛋白的多克隆抗體,首次證明了猴的Viperin蛋白具有抑制PRSV復(fù)制的作用,并揭示了其抗病毒機理。構(gòu)建了豬的Viperin蛋白腺病毒表達載體,并在Marc-145細胞和PAMSs細胞上驗證了豬Viperin蛋白對PRRSV的抗病毒作用,具體實驗如下:1.豬、猴Viperin基因的克隆及在大腸桿菌中的表達與抗體制備Viperin基因作為干擾素下游基因(ISG),本實驗為研究其抗病毒活性,從Marc-145和PK-15細胞提取并克隆了該基因。將Marc-145細胞和PK細胞鋪24板,用IFN-α刺激24h后收集細胞,提取RNA,分別采用RT-PCR方法擴增猴和豬的Viperin基因,并克隆進入pEASY-blunt simple平末端連接測序載體,酶切鑒定后送公司測序。采用DNAstar分析豬和猴Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,選取抗原性較好的一段基因,采用PCR擴增后,插入pET-28a+大腸桿菌表達載體,在37℃條件下IPTG誘導(dǎo)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21, SDS-PAGE分析證明Viperin重組蛋白以包涵體的形式表達,包涵體蛋白經(jīng)過純化后得到目的蛋白,將純化蛋白與弗式完全佐劑進行乳化后頸背部皮下注射BALB/c小鼠,兩周后加強免疫一次,收集小鼠血清。采用Western-blot、IFA實驗確定制備多克隆抗體的特異性,該多克隆抗體可以分別與腺病毒表達和真核表達載體pCI-sVIP等表達的Viperin蛋白進行特異性反應(yīng),為下一步研究豬和猴Viperin蛋白抗病毒性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。2.猴Viperin抑制PRRSV復(fù)制及其分子機制宿主抵抗病毒感染的第一道防線是先天性免疫反應(yīng)。先天性免疫反應(yīng)以干擾素的產(chǎn)生為特征,干擾素可刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列抗病毒蛋白。Viperin是干擾素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白,對多種病毒的復(fù)制有抑制作用,但抗病毒機制仍然不明確。本文研究了mViperin蛋白在Marc-145細胞內(nèi)對PRRSV復(fù)制的作用,結(jié)果表明,IFN-α接種Marc-145細胞后可誘導(dǎo)mViperin基因的上調(diào),并可以以劑量依賴和時間依賴的方式抑制PRRSV復(fù)制。PRRSV感染細胞后,IFN-α基因的上調(diào)受到明顯抑制,PRRSV通過干擾素非依賴途徑誘導(dǎo)mViperin基因的表達。用過表達mViperin蛋白可通過劑量依賴的方式抑制PRRSV在Marc-145細胞內(nèi)的復(fù)制,采用干擾siRNA方法缺失細胞內(nèi)Viperin蛋白基因,PRRSV復(fù)制水平有所增加。此外,本研究發(fā)現(xiàn)mViperin蛋白抑制了 PRRSV的入胞,阻礙了 PRRSV基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,但其對病毒的裝配和出殼沒有作用。利用激光共聚焦實驗證明mViperin蛋白和PRRSV的GP5、N蛋白在細胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。進一步用CO-IP實驗驗證,mViperin蛋白和PRRSV N蛋白在細胞內(nèi)可相互作用,并發(fā)現(xiàn)mViperin蛋白N端第12-16位氨基酸對mViperin的抗病毒活性有重要的影響,mViperin α-helix區(qū)域影響該蛋白在細胞內(nèi)的定位和形態(tài)分布。3.豬Viperin重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定Viperin作為干擾素刺激基因,在多種體細胞均有表達,且對多種種屬的病毒具有抗病毒活性。為了深入研究豬的Viperin蛋白在Marc-145和PAMS細胞上的抗病毒活性,本研究通過PCR擴增豬Viperin基因,克隆進入穿梭載體pTrack-CMV-sViperin,經(jīng)菌液PCR,酶切鑒定后送公司測序正確。利用Pme-I內(nèi)切酶線性化穿梭載體,電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1進行同源重組,提取重組后的腺病毒基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶Pac-I線性化后轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞,裝配成完整的病毒粒子rAd-Viperin。在顯微鏡下觀察重組腺病毒rAd-Viperin感染細胞,可見GFP的表達。通過RT-PCR、Western-blot檢測sViperin蛋白的表達,重組腺病毒可正確表達豬Viperin蛋白,且具有良好的豬Viperin反應(yīng)原性,為下一步研究堵Viperin蛋白對PRRSV的抗病毒活性奠定基礎(chǔ)。4.豬Viperin蛋白抑制PRRSV復(fù)制作用研究本研究構(gòu)建了 pCI-sVIP表達載體,并利用pCI-sVIP研究了 sViperin蛋白在Marc-145細胞上對PRRSV復(fù)制的作用,結(jié)果表明,過表達sViperin蛋白可以抑制PRRSV在Marc-145細胞上的復(fù)制,且具有劑量依賴作用。實驗證明sViperin蛋白抑制病毒的入胞,但其對病毒的裝配和釋放沒有影響作用。另外,共聚焦實驗證明sViperin蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器。sViperin蛋白和病毒的GP5、N蛋白在Marc-145細胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象,進一步利用CO-IP實驗證明,sViperin蛋白可以和N蛋白進行共沉淀,證明sVierin蛋白可以和N蛋白相互作用。進一步采用表達重組sViperin蛋白的腺病毒rAd-sVIP接種PAMSs細胞,結(jié)果證明過表達sViperin在PAMSs細胞以劑量依賴的方式抑制PRRSV的復(fù)制,且腺病毒表達的sViperin同樣可抑制PRRSV的入胞。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
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本文編號：1272728