發(fā)布時間：2017-12-10 04:30

  本文關(guān)鍵詞：通過大豆毛狀根體系快速驗證GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15的基因功能

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【摘要】：目的:大豆[Glycine max(L.)merrill.]是重要的油料作物,鹽脅迫是限制其產(chǎn)量的主要因素之一,了解大豆耐鹽分子機制對于增加大豆耐鹽能力具有重要作用。植物響應(yīng)鹽脅迫受到一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,這其中轉(zhuǎn)錄因子(TFs)起到了重要作用。NAC[No apical meristem(NAM),Arabidopsis transcription activation factor(ATAF),Cup-shaped cotyledon(CUC)]是植物特有的一個轉(zhuǎn)錄因子家族,由N端保守的DNA結(jié)合區(qū)域和C端多變的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域組成。NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅與植物的生長發(fā)育有關(guān),同時也涉及到植物對生物與非生物脅迫的響應(yīng)。因此,研究NAC在響應(yīng)鹽脅迫時的功能對于提高大豆耐鹽能力具有重要作用。方法:在本研究中沒有用傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法研究基因功能。傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法具有轉(zhuǎn)化效率低,過程復(fù)雜,易污染,周期長等缺點,發(fā)根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)介導(dǎo)的毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化體系可以有效的解決這些問題,另外此法可以研究根特異性表達基因。用同源重組方法將GmNAC08(Glyma08g18470.1)、GmNAC06(Glyma06g21020.1)與GmNAC15(Glyma15g40510.1)克隆到pCAMBIA3301載體35S啟動子下游,同時構(gòu)建GmNAC08和GmNAC06的突變體表達載體。然后轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599形成復(fù)合體植株。復(fù)合體包含野生葉片和轉(zhuǎn)基因毛狀根,用于基因功能研究。結(jié)果和結(jié)論:(1)GmNAC08:qRT-PCR和RT-PCR檢測GmNAC08在大豆不同組織的表達量,結(jié)果表明GmNAC08在根和子葉中的表達高于其它組織。GmNAC08在根中響應(yīng)鹽、旱與冷脅迫。GmNAC08在葉片中響應(yīng)鹽、旱、外源ABA與冷脅迫。不同的鹽濃度梯度處理四周后,qRT-PCR和RT-PCR檢測大豆根和葉片中GmNAC08的表達量,表明GmNAC08在第四周響應(yīng)鹽脅迫。250mM NaCl連續(xù)處理大豆復(fù)合體植株兩周,每周澆3次NaCl溶液,結(jié)果顯示過表達復(fù)合體(Overexpression composite,OE)植株耐鹽能力增加,突變體復(fù)合體(CRISPR/Cas9 composite,Mutant)耐鹽能力減弱。用DAB、NBT與臺盼藍對過表達復(fù)合體、空載對照復(fù)合體(vector control composite,VC)和突變體復(fù)合體葉片進行染色以及葉綠素含量和電解質(zhì)滲出率的測定,表明復(fù)合體中轉(zhuǎn)基因毛狀根可以影響野生型葉片的功能。qRT-PCR和RT-PCR檢測過表達復(fù)合體植株中毛狀根和葉片中GmNAC08的表達量,結(jié)果表明毛狀根中過表達GmNAC08并不能影響葉片中GmNAC08的表達量。丙二醛含量測定,甜菜堿含量測定以及在正常生長條件下過表達GmNAC08毛狀根中鹽脅迫抗性基因GmWRKY54、GmERF3、GmREF7與GmMYB177表達量的提高說明GmNAC08在植物鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。煙草瞬時表達證明GmNAC08是miR164a的靶基因。(2)GmNAC06:qRT-PCR和RT-PCR檢測GmNAC06在大豆不同組織的表達量,結(jié)果表明,GmNAC06在根和子葉中的表達高于其它組織。GmNAC06在根中響應(yīng)鹽和冷脅迫。GmNAC06在葉片中響應(yīng)鹽、旱、外源ABA與冷脅迫。不同的鹽濃度梯度處理四周后,qRT-PCR和RT-PCR檢測大豆根和葉片中GmNAC06的表達量,表明GmNAC06在第四周響應(yīng)鹽脅迫。250mM NaCl連續(xù)處理大豆復(fù)合體植株兩周,每周澆3次NaCl溶液,結(jié)果顯示過表達復(fù)合體植株耐鹽能力增加,突變體復(fù)合體耐鹽能力降低。用DAB和NBT對過表達復(fù)合體、空載對照復(fù)合體和突變體復(fù)合體葉片進行染色,檢測葉片中H2O2和O2-的積累,結(jié)果表明過表達復(fù)合體的葉片可以較為有效的清除活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),而突變體復(fù)合體的葉片受到ROS傷害比空載對照復(fù)合體更嚴重。臺盼藍染色表明鹽脅迫導(dǎo)致突變體復(fù)合體的葉片細胞死亡最嚴重,可能與ROS的積累有關(guān)系。葉綠素含量和電解質(zhì)滲出率的測定表明復(fù)合體中轉(zhuǎn)基因毛狀根可以影響野生型葉片的功能。qRT-PCR和RT-PCR檢測發(fā)根農(nóng)桿菌侵染一個月的過表達復(fù)合體中根和葉片的GmNAC06表達量,結(jié)果表明毛狀根中過表達GmNAC06并不能影響葉片中GmNAC06的表達量。丙二醛含量測定表明在毛狀根中過表達GmNAC06可以較為有效的清除ROS。甜菜堿含量測定表明在毛狀根中過表達GmNAC06可以積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)提高復(fù)合體植株耐鹽能力。另外,在正常生長條件下過表達GmNAC06毛狀根中鹽脅迫抗性基因GmUBC2和GmHKT1表達量提高。這些數(shù)據(jù)說明過表達GmNAC06可以增加復(fù)合體植株耐鹽能力。(3)GmNAC15:qRT-PCR和RT-PCR檢測GmNAC15在大豆不同組織的表達量,結(jié)果表明GmNAC15在根和子葉中的表達高于其它組織。GmNAC15在根和葉片中響應(yīng)鹽、旱、外源ABA與冷脅迫。為了分析GmNAC15的基因功能,250mM NaCl連續(xù)處理大豆復(fù)合體植株兩周,每周澆3次NaCl溶液,結(jié)果顯示過表達復(fù)合體植株耐鹽能力增加。用DAB、NBT、臺盼藍對過表達復(fù)合體和空載對照復(fù)合體葉片進行染色以及葉綠素含量的測定,表明復(fù)合體中轉(zhuǎn)基因毛狀根可以影響野生型葉片的功能。qRT-PCR和RT-PCR檢測過表達復(fù)合體毛狀根和葉片中的GmNAC15表達量,結(jié)果表明毛狀根中過表達GmNAC15并不能影響葉片中GmNAC15的表達量。丙二醛含量測定,甜菜堿含量檢測以及在正常生長條件下過表達GmNAC15毛狀根中鹽脅迫抗性基因GmERF3和GmWRKY54表達量提高。這些數(shù)據(jù)說明過表達GmNAC15可以增加復(fù)合體植株耐鹽能力。綜上所述,毛狀根過表達GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15增加復(fù)合體耐鹽能力,轉(zhuǎn)基因毛狀根影響葉片功能。GmNAC08、GmNAC06和GmNAC15在大豆耐鹽機制中是一個正向調(diào)控因子。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S565.1

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