發(fā)布時間：2017-12-10 11:10

  本文關鍵詞：表皮生長因子參與鵝卵泡顆粒細胞增殖調(diào)控機理的研究

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【摘要】：研究表明,動物卵泡的生長發(fā)育和成熟及其獨特的等級排卵是在生殖激素和一系列生長因子的精確調(diào)控下進行的,EGF作為一種關鍵的生長因子參與了雞、人及大鼠等動物原始卵泡的生長啟動以及卵泡發(fā)育、成熟的調(diào)節(jié)。而鵝作為一種產(chǎn)蛋量低,且呈季節(jié)性繁殖的家禽,其卵泡的生長發(fā)育和成熟是否也受生殖激素和一系列生長因子調(diào)節(jié),目前尚未見有報道。本研究在開展鵝卵泡發(fā)育過程形態(tài)組織學研究的基礎上,深入探討了EGF參與FSH介導鵝顆粒細胞增殖的作用機制。為探討鵝卵泡發(fā)育過程中各級卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,通過組織形態(tài)學方法對鵝卵泡發(fā)生發(fā)育過程中形態(tài)學變化進行了研究。與開產(chǎn)前期相比,產(chǎn)蛋期鵝卵巢重量迅速增加,生長有5或6個等級卵泡(依體積從大到小命名為F1、F2...F5或F6)和等級前卵泡(SWF、LWF、SYF、LYF)。進入就巢期后不同等級的卵泡出現(xiàn)閉鎖,卵泡基本停止發(fā)育,卵巢出現(xiàn)萎縮和退化。透射電鏡觀察結(jié)果顯示,就巢鵝閉鎖卵泡邊界不清晰,失去完整結(jié)構(gòu)。在產(chǎn)蛋期內(nèi),LYF顆粒細胞厚度達22.18μm,當進入等級發(fā)育后顆粒細胞厚度變薄,F1時期顆粒細胞厚度僅為12.53 μm；在等級前卵泡階段,膜細胞層緩慢增厚,SWF時期膜層厚度僅為40.61μm,進入等級發(fā)育以后膜細胞層厚度迅速增加,F4時期達到308.30μm,增加到原來的7.7倍。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)對各級卵泡內(nèi)激素及生長因子含量進行測定,發(fā)現(xiàn)在卵泡發(fā)育過程之中FSH出現(xiàn)了2個峰值(SYF、F2時期的FSH濃度分別為59.24 mIU/mg、46.06 mIU/mg), LH也與FSH表現(xiàn)出相似的趨勢,但在LYF、F4時期出現(xiàn)峰值；而P4和E2在卵泡等級發(fā)育過程中呈現(xiàn)出下降的趨勢,且在LWF、SWF時期明顯高于其他時期(P0.05)。對各級卵泡的EGF含量進行測定,結(jié)果表明在卵泡由等級前向等級卵泡發(fā)育過程中,在SYF和LYF時期顯著高于其他發(fā)育時期(P0.05),分別達68.65 pg/mg和46.73 pg/mg。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,EGF及其受體EGFR在SYF時期相對表達量最高,分別為F1時期的10.17倍和5.87倍,總體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢。由上可以看出,在鵝卵泡發(fā)育過程中,其形態(tài)結(jié)構(gòu)、FSH與LH等生殖激素以及EGF含量發(fā)生了顯著變化,其中SYF時期是發(fā)生變化的關鍵階段。為進一步闡明EGF和FSH對鵝等級前卵泡發(fā)育及卵泡顆粒細胞增殖的調(diào)控作用。通過選取SYF分離顆粒細胞培養(yǎng),比較不同濃度EGF (0 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)和FSH (0 mIU/mL、25 mIU/mL、50 mIU/mL和100 mIU/mL)對鵝顆粒細胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EGF和FSH聯(lián)合作用對鵝等級前卵泡顆粒細胞有促增殖作用,在EGF(濃度為10 ng/mL)和FSH(濃度為50 mIU/mL)共同處理下,顆粒細胞增殖效果顯著(P0.05)。分離鵝等級前卵泡進行體外懸浮培養(yǎng),經(jīng)EGF (10 ng/mL)和FSH (50 mIU/mL)單獨或者共同處理24 h后,顆粒細胞層和膜細胞層均增厚,當兩者共同處理時,SYF顆粒細胞層厚度和膜細胞層厚度分別增加4.16 μm,8.36 μm (P0.05)。同時還發(fā)現(xiàn)在EGF和FSH共同作用下,顆粒細胞中抗凋亡基因Bcl-2表達量上升12倍(P0.05),促凋亡基因Bax表達量下降了3倍(P0.05)。由此可以看出,EGF可促進鵝卵泡顆粒細胞的增殖,抑制細胞凋亡,而且在FSH存在的情況下,這種作用進一步加強。為探討EGF對參與顆粒細胞凋亡關鍵基因Smad4表達水平的影響,首先克隆了鵝Smad4基因(Genbank登錄號：KU363745),發(fā)現(xiàn)了其一種可變剪接形式Smad4-b (Genbank登錄號：KU363746),經(jīng)過比對,發(fā)現(xiàn)第5外顯子完全缺失。RT-qPCR檢測顯不,Smad4基因的2種剪接形式在下丘腦,垂體,卵巢,輸卵管等繁殖組織中都有表達,并以Smad4-a(野生型)為主(P0.01),且組織豐度依次為：輸卵管卵巢垂體下丘腦。顆粒細胞經(jīng)EGF處理后,Smad4-a的表達顯著下調(diào)(P0.05)。為進一步探討產(chǎn)蛋鵝與就巢鵝卵巢miRNA對顆粒細胞增殖的影響。選取產(chǎn)蛋期和就巢期鵝卵巢基質(zhì)組織,采用Solexa深度測序技術(shù)對產(chǎn)蛋鵝和就巢鵝卵巢組織差異miRNA進行測序,共獲得了353條差異表達的miRNA,相對于產(chǎn)蛋鵝卵巢,有127條miRNAs在就巢鵝卵巢表達上調(diào),126條miRNAs表達下調(diào)。GO注釋和KEGG通路分析顯示,差異表達的miRNA參與了激素的分泌、再生過程等生物學過程。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示,經(jīng)EGF或FSH處理后,miR-26b、miR-27a、miR-27b等miRNA表達均顯著上調(diào)(P0.01), miR-22、miR-27c、miR-34基因表達下調(diào)。差異miRNA靶基因預測發(fā)現(xiàn),Smad4即為miR-26b候選靶基因之一,趨勢與miR-26b相反。推測EGF參與鵝顆粒細胞增殖很可能依賴于miR-26b靶向于Smad4來實現(xiàn)的。上述結(jié)果表明,以上關鍵miRNA在EGF介導的顆粒細胞增殖的過程中發(fā)揮了一定作用�？傊�,本研究分析了產(chǎn)蛋鵝卵巢卵泡發(fā)育的形態(tài)學圖譜,測定了卵泡內(nèi)關鍵激素以及因子的濃度,探究EGF和FSH互作對鵝體外培養(yǎng)卵泡以及顆粒細胞的作用,并探討了EGF參與卵泡顆粒細胞凋亡關鍵基因Smad4及關鍵候選miRNAs表達調(diào)控研究,上述研究結(jié)果將有助于全面了解EGF參與鵝生殖調(diào)控過程分子機制,為未來提高鵝繁殖力,壯大鵝產(chǎn)業(yè)提供一定的理論支撐。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S835

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本文編號：1274237