發(fā)布時(shí)間：2017-12-10 13:38

  本文關(guān)鍵詞：接種松材線蟲后抗性馬尾松的防御物質(zhì)變化及轉(zhuǎn)錄組分析

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【摘要】：松材線蟲病是由松材線蟲引起的一種毀滅性的的森林病害,嚴(yán)重威脅著森林生態(tài)安全,并給林業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。馬尾松是我國(guó)南方主要的鄉(xiāng)土針葉樹種,為松材線蟲主要危害對(duì)象之一。馬尾松中存在抗病基因型,利用抗病品種代替易感品種是防治松材線蟲病最為經(jīng)濟(jì)有效的措施,但目前對(duì)抗性機(jī)制并不清楚。因此,本研究對(duì)已經(jīng)經(jīng)過嚴(yán)格接種松材線蟲試驗(yàn)而選出的不同抗性指數(shù)馬尾松無(wú)性系進(jìn)行生理生化測(cè)定以及解剖結(jié)構(gòu)觀察,并運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù),從轉(zhuǎn)錄組水平檢測(cè)高抗與易感馬尾松基因型對(duì)松材線蟲的響應(yīng)差異,以期了解松脂在馬尾松抗松材線蟲病中的分子機(jī)制,為抗性植株的早期鑒定和選擇奠定理論基礎(chǔ)。研究主要取得以下成果:(1)通過對(duì)不同抗性指數(shù)馬尾松無(wú)性系松脂產(chǎn)量和各組分含量進(jìn)行分析,共檢測(cè)出19種松脂組分,單萜類、倍半萜類、雙萜類組分含量分別占松脂含量的12.08%、5.16%和79.53%,除α-蒎烯、β-水芹烯、蒈烯、山達(dá)海松酸、新樅酸在不同抗性間差異不顯著外,其余14種組分均達(dá)到顯著或極顯著水平。抗性指數(shù)與產(chǎn)脂量呈顯著性正相關(guān)(r=0.169),與松脂組分中的莰烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.507~0.622),與長(zhǎng)葉烯呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.420)。這表明可以根據(jù)松脂產(chǎn)量或組分含量對(duì)馬尾松的抗性進(jìn)行初步判定。未受線蟲侵襲時(shí),α-蒎烯在不同抗性無(wú)性系之間差異不顯著,均值變幅在178~198μg·mL-1之間;不同抗性指數(shù)β-蒎烯和檸檬烯含量差異顯著,高抗無(wú)性系分別是易感無(wú)性系的2.11倍和2.42倍;易感無(wú)性系長(zhǎng)葉烯含量是高抗無(wú)性系的1.92倍。受到線蟲侵染后,α-蒎烯、檸檬烯、β-蒎烯、長(zhǎng)葉烯在不同抗性無(wú)性系間達(dá)到顯著或極顯著差異;接種后1d,高抗無(wú)性系α-蒎烯顯著低于易感無(wú)性系,接種后7d-15d,高抗無(wú)性系的α-蒎烯含量顯著高于易感無(wú)性系;接種后1d和7d,高抗與易感無(wú)性系的β-蒎烯所占比例之間達(dá)到顯著差異;高抗無(wú)性系的檸檬烯比例顯著高于易感無(wú)性系,約為后者的1.79倍;易感無(wú)性系的長(zhǎng)葉烯比例比高抗無(wú)性系高13.32%。說(shuō)明α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、長(zhǎng)葉烯與馬尾松的抗性密切相關(guān),受松材線蟲侵襲后起主要防御作用的萜烯類組分通過改變?cè)谒芍�中比例�?lái)發(fā)揮效用。(2)對(duì)分泌和運(yùn)輸松脂的樹脂道結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)觀察,結(jié)果表明不同抗性馬尾松無(wú)性系的樹脂道差異顯著,受線蟲侵襲后高抗馬尾松無(wú)性系的樹脂道面積約為易感無(wú)性系的1.4倍。同時(shí)對(duì)不同產(chǎn)脂量馬尾松無(wú)性系的樹脂道結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察,發(fā)現(xiàn)低產(chǎn)脂量馬尾松無(wú)性系的樹脂道面積比高產(chǎn)脂量無(wú)性系低10.83%。受到機(jī)械創(chuàng)傷后,高產(chǎn)脂量無(wú)性系樹脂道面積增幅是低產(chǎn)脂量的2.02倍。由相同的變化趨勢(shì)可以推測(cè)不同抗性無(wú)性系與不同產(chǎn)脂量無(wú)性系響應(yīng)刺激的防衛(wèi)反應(yīng)可能相似,這從解剖結(jié)構(gòu)上驗(yàn)證了抗性指數(shù)與松脂產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)的結(jié)論。(3)接種松材線蟲后,對(duì)不同抗性馬尾松無(wú)性系針葉內(nèi)的信號(hào)分子(h2o2、o2·-、no、ca2+)含量進(jìn)行了監(jiān)測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),高抗與感病馬尾松無(wú)性系針葉內(nèi)h2o2含量在整個(gè)侵襲進(jìn)程中均達(dá)到顯著性差異,高抗無(wú)性系在1d時(shí)比易感無(wú)性系高14.22%。接種后3d及隨后進(jìn)程中,高抗無(wú)性系的h2o2含量均顯著低于易感無(wú)性系。接種后15d,易感無(wú)性系的h2o2含量是高抗無(wú)性系的1.7倍;除接種后1d外,在接種后3d~30d,高抗與易感馬尾松無(wú)性系的o2·-含量之間均達(dá)到顯著差異水平,接種后3d~15d,高抗無(wú)性系比易感無(wú)性系的o2·-含量分別高21.27%、26.36%和16.43%,而接種后30d,易感無(wú)性系o2·-含量顯著高于比高抗無(wú)性系43.35%;除接種后7d外,其他時(shí)間點(diǎn)的no含量在高抗與易感無(wú)性系之間均達(dá)到顯著性差異。不同抗性馬尾松無(wú)性系針葉內(nèi)ca2+含量變化趨勢(shì)類似,但不同時(shí)間點(diǎn)均呈現(xiàn)顯著性差異,高抗無(wú)性系在接種后1d比易感無(wú)性系高15.83%。接種后3d時(shí)易感無(wú)性系比高抗無(wú)性系高27.69%,接種后7d,易感無(wú)性系是高抗無(wú)性系高1.86倍,接種后15d高抗無(wú)性系比易感無(wú)性系高23.85%,高抗無(wú)性系在接種后30d比易感無(wú)性系低41.74%。以上結(jié)果表明馬尾松受到線蟲侵襲后,h2o2、o2·-、no、ca2+等信號(hào)分子迅速傳遞刺激信息,參與系統(tǒng)性防衛(wèi)反應(yīng),是馬尾松抗性機(jī)制中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組成部分。(4)接種線蟲后,不同抗性馬尾松無(wú)性系內(nèi)源激素(sa、ja)含量差異很大。高抗馬尾松無(wú)性系與易感無(wú)性系針葉內(nèi)水楊酸含量在不同時(shí)間點(diǎn)均達(dá)到顯著差異,接種后1d和30d,高抗無(wú)性系針葉內(nèi)水楊酸含量分別為易感無(wú)性系的2.88倍和2.36倍;在其他時(shí)間點(diǎn),高抗無(wú)性系水楊酸含量也顯著高于易感無(wú)性系,為易感無(wú)性系水楊酸含量的1.14~1.68倍。除接種后7d外,不同抗性馬尾松無(wú)性系針葉內(nèi)茉莉酸含量均呈現(xiàn)顯著性差異,接種后1d和3d時(shí),高抗無(wú)性系的茉莉酸含量為分別易感無(wú)性系的3.52倍和1.93倍;接種后15d,高抗無(wú)性系的茉莉酸含量?jī)H為易感無(wú)性系的67.74%;高抗無(wú)性系在接種后30d為易感無(wú)性系的1.56倍。表明植物內(nèi)源激素水楊酸和茉莉酸參與了馬尾松的防御響應(yīng),可能起到調(diào)節(jié)松脂合成的作用。(5)運(yùn)用RNA-seq技術(shù),對(duì)不同抗性馬尾松接種松材線蟲后1d、15d和30d的莖段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得80 340條unigenes,平均長(zhǎng)度為675 nt,其中50 227個(gè)(62.5%)unigenes基因獲得了功能注釋。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper三種方法發(fā)現(xiàn)U2af、β-TUB、EF和CAC在高抗和易感基因型不同時(shí)間點(diǎn)中表達(dá)穩(wěn)定,為最佳內(nèi)參基因。在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn),易感基因型的差異表達(dá)基因數(shù)量均比高抗基因型的多,且大部分差異基因下調(diào),表明受到松材線蟲侵染后,易感植株體內(nèi)的生理生化變化較為嚴(yán)重。高抗和易感無(wú)性系接種后15天時(shí)差異表達(dá)基因的數(shù)量最高分別為371和2 179,而接種后30天時(shí)差異表達(dá)基因最少。差異基因中與萜類合成相關(guān)的基因DXS、HDS、MECPS、HMGR、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(+)-α-蒎烯合酶、(-)-α/β-蒎烯合酶、(-)-檸檬烯合酶、長(zhǎng)葉烯合酶、Δ-芹子烯合酶和CYP720B等在接種松材線蟲后表達(dá)量皆發(fā)生了顯著變化;其中DXS、HMGR、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(+)-α-蒎烯合酶、(-)-檸檬烯合酶、長(zhǎng)葉烯合酶和CYP720B在接種松材線蟲的高抗和易感基因型間差異極顯著,意味著這些基因可能與馬尾松的抗性有關(guān)。另外,病程相關(guān)基因、細(xì)胞壁相關(guān)基因和活性氧(ROS)響應(yīng)基因以及其它一些抗性基因在高抗或易感基因型中受松材線蟲侵襲后表達(dá)量也發(fā)生顯著改變,但僅發(fā)現(xiàn)編碼PR3和防御素-1的基因在高抗和易感基因型間差異極顯著。這些基因在轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)結(jié)果與qRT-PCR分析結(jié)果一致。差異基因表達(dá)情況與松脂組分、信號(hào)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化相符,說(shuō)明馬尾松接種線蟲后,產(chǎn)生系統(tǒng)性防御反應(yīng),多種抗性機(jī)制共同發(fā)揮作用,以抵御線蟲的侵襲。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S791.248
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本文編號(hào)：1274666