發(fā)布時間：2017-12-10 13:38

  本文關鍵詞：接種松材線蟲后抗性馬尾松的防御物質變化及轉錄組分析

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【摘要】：松材線蟲病是由松材線蟲引起的一種毀滅性的的森林病害,嚴重威脅著森林生態(tài)安全,并給林業(yè)帶來巨大的經濟損失。馬尾松是我國南方主要的鄉(xiāng)土針葉樹種,為松材線蟲主要危害對象之一。馬尾松中存在抗病基因型,利用抗病品種代替易感品種是防治松材線蟲病最為經濟有效的措施,但目前對抗性機制并不清楚。因此,本研究對已經經過嚴格接種松材線蟲試驗而選出的不同抗性指數(shù)馬尾松無性系進行生理生化測定以及解剖結構觀察,并運用高通量測序技術,從轉錄組水平檢測高抗與易感馬尾松基因型對松材線蟲的響應差異,以期了解松脂在馬尾松抗松材線蟲病中的分子機制,為抗性植株的早期鑒定和選擇奠定理論基礎。研究主要取得以下成果:(1)通過對不同抗性指數(shù)馬尾松無性系松脂產量和各組分含量進行分析,共檢測出19種松脂組分,單萜類、倍半萜類、雙萜類組分含量分別占松脂含量的12.08%、5.16%和79.53%,除α-蒎烯、β-水芹烯、蒈烯、山達海松酸、新樅酸在不同抗性間差異不顯著外,其余14種組分均達到顯著或極顯著水平�？剐灾笖�(shù)與產脂量呈顯著性正相關(r=0.169),與松脂組分中的莰烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯均呈現(xiàn)極顯著正相關(r=0.507~0.622),與長葉烯呈極顯著負相關(r=-0.420)。這表明可以根據(jù)松脂產量或組分含量對馬尾松的抗性進行初步判定。未受線蟲侵襲時,α-蒎烯在不同抗性無性系之間差異不顯著,均值變幅在178~198μg·mL-1之間;不同抗性指數(shù)β-蒎烯和檸檬烯含量差異顯著,高抗無性系分別是易感無性系的2.11倍和2.42倍;易感無性系長葉烯含量是高抗無性系的1.92倍。受到線蟲侵染后,α-蒎烯、檸檬烯、β-蒎烯、長葉烯在不同抗性無性系間達到顯著或極顯著差異;接種后1d,高抗無性系α-蒎烯顯著低于易感無性系,接種后7d-15d,高抗無性系的α-蒎烯含量顯著高于易感無性系;接種后1d和7d,高抗與易感無性系的β-蒎烯所占比例之間達到顯著差異;高抗無性系的檸檬烯比例顯著高于易感無性系,約為后者的1.79倍;易感無性系的長葉烯比例比高抗無性系高13.32%。說明α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、長葉烯與馬尾松的抗性密切相關,受松材線蟲侵襲后起主要防御作用的萜烯類組分通過改變在松脂中比例來發(fā)揮效用。(2)對分泌和運輸松脂的樹脂道結構進行了系統(tǒng)觀察,結果表明不同抗性馬尾松無性系的樹脂道差異顯著,受線蟲侵襲后高抗馬尾松無性系的樹脂道面積約為易感無性系的1.4倍。同時對不同產脂量馬尾松無性系的樹脂道結構進行了觀察,發(fā)現(xiàn)低產脂量馬尾松無性系的樹脂道面積比高產脂量無性系低10.83%。受到機械創(chuàng)傷后,高產脂量無性系樹脂道面積增幅是低產脂量的2.02倍。由相同的變化趨勢可以推測不同抗性無性系與不同產脂量無性系響應刺激的防衛(wèi)反應可能相似,這從解剖結構上驗證了抗性指數(shù)與松脂產量呈顯著正相關的結論。(3)接種松材線蟲后,對不同抗性馬尾松無性系針葉內的信號分子(h2o2、o2·-、no、ca2+)含量進行了監(jiān)測,結果發(fā)現(xiàn),高抗與感病馬尾松無性系針葉內h2o2含量在整個侵襲進程中均達到顯著性差異,高抗無性系在1d時比易感無性系高14.22%。接種后3d及隨后進程中,高抗無性系的h2o2含量均顯著低于易感無性系。接種后15d,易感無性系的h2o2含量是高抗無性系的1.7倍;除接種后1d外,在接種后3d~30d,高抗與易感馬尾松無性系的o2·-含量之間均達到顯著差異水平,接種后3d~15d,高抗無性系比易感無性系的o2·-含量分別高21.27%、26.36%和16.43%,而接種后30d,易感無性系o2·-含量顯著高于比高抗無性系43.35%;除接種后7d外,其他時間點的no含量在高抗與易感無性系之間均達到顯著性差異。不同抗性馬尾松無性系針葉內ca2+含量變化趨勢類似,但不同時間點均呈現(xiàn)顯著性差異,高抗無性系在接種后1d比易感無性系高15.83%。接種后3d時易感無性系比高抗無性系高27.69%,接種后7d,易感無性系是高抗無性系高1.86倍,接種后15d高抗無性系比易感無性系高23.85%,高抗無性系在接種后30d比易感無性系低41.74%。以上結果表明馬尾松受到線蟲侵襲后,h2o2、o2·-、no、ca2+等信號分子迅速傳遞刺激信息,參與系統(tǒng)性防衛(wèi)反應,是馬尾松抗性機制中信號轉導途徑的重要組成部分。(4)接種線蟲后,不同抗性馬尾松無性系內源激素(sa、ja)含量差異很大。高抗馬尾松無性系與易感無性系針葉內水楊酸含量在不同時間點均達到顯著差異,接種后1d和30d,高抗無性系針葉內水楊酸含量分別為易感無性系的2.88倍和2.36倍;在其他時間點,高抗無性系水楊酸含量也顯著高于易感無性系,為易感無性系水楊酸含量的1.14~1.68倍。除接種后7d外,不同抗性馬尾松無性系針葉內茉莉酸含量均呈現(xiàn)顯著性差異,接種后1d和3d時,高抗無性系的茉莉酸含量為分別易感無性系的3.52倍和1.93倍;接種后15d,高抗無性系的茉莉酸含量僅為易感無性系的67.74%;高抗無性系在接種后30d為易感無性系的1.56倍。表明植物內源激素水楊酸和茉莉酸參與了馬尾松的防御響應,可能起到調節(jié)松脂合成的作用。(5)運用RNA-seq技術,對不同抗性馬尾松接種松材線蟲后1d、15d和30d的莖段進行轉錄組測序,共獲得80 340條unigenes,平均長度為675 nt,其中50 227個(62.5%)unigenes基因獲得了功能注釋。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper三種方法發(fā)現(xiàn)U2af、β-TUB、EF和CAC在高抗和易感基因型不同時間點中表達穩(wěn)定,為最佳內參基因。在每個時間節(jié)點,易感基因型的差異表達基因數(shù)量均比高抗基因型的多,且大部分差異基因下調,表明受到松材線蟲侵染后,易感植株體內的生理生化變化較為嚴重。高抗和易感無性系接種后15天時差異表達基因的數(shù)量最高分別為371和2 179,而接種后30天時差異表達基因最少。差異基因中與萜類合成相關的基因DXS、HDS、MECPS、HMGR、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(+)-α-蒎烯合酶、(-)-α/β-蒎烯合酶、(-)-檸檬烯合酶、長葉烯合酶、Δ-芹子烯合酶和CYP720B等在接種松材線蟲后表達量皆發(fā)生了顯著變化;其中DXS、HMGR、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(+)-α-蒎烯合酶、(-)-檸檬烯合酶、長葉烯合酶和CYP720B在接種松材線蟲的高抗和易感基因型間差異極顯著,意味著這些基因可能與馬尾松的抗性有關。另外,病程相關基因、細胞壁相關基因和活性氧(ROS)響應基因以及其它一些抗性基因在高抗或易感基因型中受松材線蟲侵襲后表達量也發(fā)生顯著改變,但僅發(fā)現(xiàn)編碼PR3和防御素-1的基因在高抗和易感基因型間差異極顯著。這些基因在轉錄組中表達結果與qRT-PCR分析結果一致。差異基因表達情況與松脂組分、信號物質的動態(tài)變化相符,說明馬尾松接種線蟲后,產生系統(tǒng)性防御反應,多種抗性機制共同發(fā)揮作用,以抵御線蟲的侵襲。
【學位授予單位】：中國林業(yè)科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S791.248
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本文編號：1274666