發(fā)布時間：2017-12-10 14:08

  本文關(guān)鍵詞：活性氧和兼性共生菌在豌豆蚜免疫系統(tǒng)中的作用研究

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【摘要】：豌豆蚜Acyrthosiphon pisum是第一個完成基因組測序的半翅目昆蟲,且含有一種專性共生菌布赫氏體Buchnera aphidicola和多種兼性共生菌,因此是研究蚜蟲和微生物相互作用的很好的模式昆蟲。截止目前,對于豌豆蚜的免疫的研究仍十分有限�；钚匝�(reactive oxygen species,ROS)能夠被有機體通過氧化迸發(fā)的形式迅速產(chǎn)生來抵御病原物的感染,之前的研究暗示活性氧可能在豌豆蚜免疫中起作用,而兼性共生菌能夠保護蚜蟲抵御寄生蜂和病原真菌的寄生和侵染。本研究中,我們測定了細菌感染以后豌豆蚜體內(nèi)的活性氧水平以及活性氧相關(guān)基因的表達,克隆及表達了豌豆蚜過氧化物氧化還原酶1和2(A.pisum Peroxiredoxin 1,2,ApPrx1,ApPrx2)并分析了其在豌豆蚜免疫中的作用;鑒定了實驗室豌豆蚜品系兼性共生菌的類型,通過存活率的比較探明了兼性共生菌對豌豆蚜免疫的影響,并測定了病原菌感染后豌豆蚜共生菌種群密度的變化。主要結(jié)果如下:革蘭氏陰性菌綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa和革蘭氏陽性菌藤黃微球菌Micrococcus luteus感染均能造成豌豆蚜顯著死亡,而綠膿桿菌感染后豌豆蚜的死亡率更加顯著。綠膿桿菌和藤黃微球菌的感染均能誘導蚜蟲體內(nèi)活性氧水平升高,相比之下,藤黃微球菌感染后24小數(shù)內(nèi)蚜蟲體內(nèi)活性氧水平升高的更加劇烈。包括催化活性氧產(chǎn)生的雙氧化酶(dual oxidase,DUOX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)以及活性氧解毒酶過氧化物氧化還原酶在內(nèi)的多個基因在細菌感染后均有不同程度的差異表達,上調(diào)和下調(diào)因感染后時間的不同而不同。重組ApPrx1和ApPrx2蛋白均具有抗氧化活性,能夠有效清除過氧化氫,保護DNA免受氧化損傷。當蚜蟲被細菌感染或注射過氧化氫時,ApPrx1和ApPrx2的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。通過顯微注射dsRNA對ApPrx1和ApPrx2進行RNA干擾,結(jié)果顯示,ApPrx1和ApPrx2的表達均在注射后第三天顯著降低,對ApPrx1和ApPrx2的干擾效率分別約為35%和50%。通過RNA干擾降低ApPrx1表達之后,藤黃微球菌感染的蚜蟲的存活率顯著降低,注射dsApPrx1的蚜蟲被細菌感染后其體內(nèi)的細菌數(shù)在48 h顯著低于對照,而其體內(nèi)的過氧化氫水平則顯著高于對照。干擾ApPrx2表達后,金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus感染的蚜蟲的存活率顯著降低,綠膿桿菌感染的蚜蟲的存活率無顯著變化,金黃色葡萄球菌感染的蚜蟲體內(nèi)的過氧化氫水平更高而細菌數(shù)目較低,綠膿桿菌感染后細菌數(shù)目無顯著變化,表明干擾ApPrx1和ApPrx2后蚜蟲存活率的降低是由于氧化脅迫升高導致的。通過PCR檢測實驗室豌豆蚜品系中的兼性共生菌類型,檢測到只含有Serratia symbiotica這一種兼性共生菌。顯微注射氨芐青霉素清除S.symbiotica建立了穩(wěn)定的無兼性共生菌豌豆蚜品系。利用三種革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae以及三種革蘭氏陰性細菌綠膿桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens和大腸桿菌Escherichia coli對含S.symbiotica和不含S.symbiotica的兩個品系蚜蟲進行感染,比較其存活率,發(fā)現(xiàn)S.symbiotica的有無對于6種細菌感染下的蚜蟲的存活率均無顯著影響。球孢白僵菌Beauveria bassiana感染后的兩個品系的蚜蟲的存活率也無顯著差異。檢測細菌感染以后豌豆蚜體內(nèi)共生菌的密度發(fā)現(xiàn),S.symbiotica在蚜蟲感染不同細菌后均升高約2-3倍,而專性共生菌B.aphidicola僅在蚜蟲感染革蘭氏陽性菌(特別是藤黃微球菌)后顯著升高。相比細菌感染,球孢白僵菌的感染并不引起蚜蟲體內(nèi)S.symbiotica和B.aphidicola的密度的變化。這些結(jié)果表明,兼性共生菌S.symbiotica并不影響豌豆蚜對細菌和真菌侵染的敏感性。綜合以上結(jié)果,我們初步證明了活性氧在豌豆蚜抵御細菌感染時能夠發(fā)揮作用,而過氧化物氧化還原酶在調(diào)節(jié)豌豆蚜受感染時維持活性氧穩(wěn)態(tài)中起重要作用。兼性共生菌S.symbiotica對豌豆蚜抵御細菌和真菌B.aphidicola的感染中并不起保護作用,但S.symbiotica和B.aphidicola能夠以增加自身的數(shù)量作為對外界細菌感染豌豆蚜的反應(yīng)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S433

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