發(fā)布時間：2017-12-12 07:31

  本文關(guān)鍵詞：FSH調(diào)控豬卵泡顆粒細胞自噬的分子機制研究

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【摘要】：本實驗旨在研究促卵泡激素(follicle stimulating hormone,FSH)對豬卵泡顆粒細胞自噬活性的影響及其調(diào)控通路。研究結(jié)果表明：FSH可以顯著增強體外培養(yǎng)豬卵泡中自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ的表達,并且上調(diào)顆粒細胞內(nèi)胞內(nèi)自噬體數(shù)量,通過自噬流阻斷研究顯示FSH可以增強卵泡的自噬流水平；結(jié)合上述結(jié)果我們認為FSH可以增強體外培養(yǎng)豬卵泡顆粒細胞的自噬活性。進一步研究發(fā)現(xiàn),FSH可以增強豬卵泡顆粒細胞中自噬關(guān)鍵基因beclin-1 mRNA和蛋白的表達；在添加PI3K/AKT通路特異抑制劑LY294002或SAPK/JNK通路特異抑制劑SP600125預(yù)處理顆粒細胞后,可以抑制FSH誘導(dǎo)的beclin-1上調(diào)。同時我們的研究發(fā)現(xiàn)FSH可以引起SAPK/JNK通路下游重要轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的磷酸化,使用LY294002或SP600125處理可以抑制c-Jun的磷酸化。通過核質(zhì)分離實驗和染色質(zhì)免疫共沉淀研究證明,磷酸化的c-Jun可以結(jié)合在beclin-1的啟動子上,而FSH可以促進c-Jun與beclin-1啟動子的結(jié)合。通過RNAi敲降顆粒細胞中c-Jun可以抑制FSH誘導(dǎo)的beclin-1增加,說明FSH可能通過PI3K/JNK/c-Jun通路調(diào)控顆粒細胞中beclin-1表達。此外,我們研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),FSH可以增加體外培養(yǎng)的豬顆粒細胞的孕酮分泌,通過添加自噬抑制劑氯喹以及SP600125可以抑制FSH誘導(dǎo)的孕酮分泌,且不影響顆粒細胞中孕激素合成的關(guān)鍵基因StAR和P450scc的mRNA的表達。我們的研究結(jié)果表明在豬顆粒細胞中,FSH不但可以促進孕激素合成的關(guān)鍵基因StAR和P450scc的mRNA的表達,同時還可以通過增強顆粒細胞的自噬活性促進顆粒細胞孕酮的分泌。核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB)家族在哺乳動物細胞內(nèi)的多種生命進程如細胞的增殖與分化,凋亡與炎癥中發(fā)揮重要作用。然而NF-κB在卵泡發(fā)育中的作用仍不是很清楚。本研究發(fā)現(xiàn),FSH處理可以上調(diào)豬原代顆粒細胞中的NF-κB抑制蛋白(IκB)的表達,并使NF-κB家族中RelA/p65亞單位的胞質(zhì)定位增加,說明FSH可以抑制顆粒細胞中NF-κB通路的激活。為研究NF-κB通路抑制對卵泡發(fā)育的影響,我們使用特異性NF-κB信號通路的抑制劑,PDTC (pyrrolidine dithiocarbamate)對顆粒細胞進行處理。研究結(jié)果顯示,FSH和PDTC的處理都可以引起顆粒細胞中JNK通路的激活以及自噬活性的增加。通過RNAi敲降顆粒細胞中Re1A (p65)可以抑制FSH誘導(dǎo)的JNK通路的激活以及自噬標(biāo)記蛋白beclin-1和LC3-Ⅱ的表達。同時我們的研究還發(fā)現(xiàn)FSH、PDTC都參與顆粒細胞內(nèi)孕酮的分泌,使用自噬抑制劑氯喹可以抑制FSH和PDTC誘導(dǎo)的孕酮分泌。我們的研究結(jié)果表明在顆粒細胞內(nèi)抑制NF-κB通路可以引起JNK通路的激活,增強顆粒細胞的自噬活性,進而參與顆粒細胞內(nèi)類固醇激素代謝的調(diào)控。我們的研究將為進一步揭示哺乳動物卵泡發(fā)育過程中自噬的調(diào)節(jié)機制與功能提供參考。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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本文編號：1281694