發(fā)布時間：2017-12-12 09:06

  本文關(guān)鍵詞：乳酸菌對凡納濱對蝦益生機理的研究

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【摘要】：從商業(yè)益生菌產(chǎn)品、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和矛尾蝦虎魚(Acanthogobius hasta)的腸道中共分離得到53株乳酸菌,并對這些菌株進行了溶血活性、抑菌性和粘附性的測定。實驗結(jié)果表明,53株乳酸菌均沒有溶血活性,有兩株菌在所篩選得到的菌株中分別表現(xiàn)出了較好的抑菌性和粘附性。基于16S rRNA分子生物學鑒定和生理生化實驗,確定以上兩株菌分別為戊糖乳桿菌HC-2和糞腸球菌NRW-2。探討和比較了HC-2、NRW-2和HC-2發(fā)酵上清液對凡納濱對蝦的益生作用及其益生機理。首先,在基礎飼料中分別添加HC-2、NRW-2、HC-2的發(fā)酵上清液,最終每克基礎飼料中含有1.0×107 CFU益生菌或此菌量所對應的發(fā)酵上清液,共配制3組實驗飼料,進行為期四周的投喂實驗。結(jié)果表明凡納濱對蝦投喂含有HC-2或NRW-2的飼料時,其特定生長率高于對照組;而投喂HC-2發(fā)酵上清液時,其特定生長率低于對照組但是差異不顯著。同時,利用實時定量PCR測定了對蝦中腸和肝胰腺中相關(guān)免疫基因的表達情況。實驗結(jié)果表明,飼料中添加NRW-2兩周和四周時顯著促進了凡納濱對蝦中腸中PEN-3α、proPO和lysozyme的表達;而HC-2及其發(fā)酵上清液對肝胰腺中相關(guān)免疫基因的表達具有較高的誘導作用。此外攻毒實驗顯示所有處理組中凡納濱對蝦對病原菌的抵抗力均顯著高于對照組。其次,研究了飼料中添加益生菌及其發(fā)酵上清液對凡納濱對蝦肝胰腺和腸道消化酶活性的影響。實驗結(jié)果如下:與對照組相比,各實驗組對蝦腸道中蛋白酶活力顯著提高(P0.05),但肝胰腺中蛋白酶活力無顯著差異;添加NRW-2的實驗組與對照組相比,腸道和肝胰腺中淀粉酶和脂肪酶活力均顯著提高(P0.05),HC-2組對蝦肝胰腺中淀粉酶及腸道中脂肪酶的活力顯著提高(P0.05),而HC-2發(fā)酵上清液的添加僅顯著提高了對蝦腸道蛋白酶和淀粉酶的活性。結(jié)果表明,飼料中添加NRW-2、HC-2及其發(fā)酵上清液可以提高凡納濱對蝦腸道及肝胰腺中消化酶的活力,但在不同組織中提高消化酶活性的種類是不同的。此外,利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)分析了凡納濱對蝦腸道中的細菌組成。高通量數(shù)據(jù)顯示Proteobacteria,Verrucomicrobia和Actinobacteria是各個處理組中的優(yōu)勢菌群,但各個處理組中均存在其特有的細菌種類,并且飼料中添加HC-2發(fā)酵上清液后,與對照組相比,顯著增加了對蝦腸道中Actinobacteria的豐度。以上實驗結(jié)果說明,益生菌及其發(fā)酵上清液的添加改變了對蝦腸道細菌的組成及其豐富。但是不同實驗飼料的投喂沒有明顯改善對蝦腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu),由此推測對蝦腸道中微生物群落之間復雜的相互作用或許在保持或促進對蝦健康方面發(fā)揮著重要的作用。再次,為了探討HC-2和副溶血弧菌E1(VPE1)在對蝦體內(nèi)外的相互作用,利用DAPI和CFDA-SE分別對HC-2和VPE1進行熒光標記后,用熒光顯微鏡觀察兩株菌在對蝦腸道中的分布情況。當對蝦同時投喂這兩株菌時,在對蝦腸道內(nèi)HC-2對VPE1具有一定的競爭排斥作用。此外,在體外跟蹤測定了HC-2與VPE1共培養(yǎng)或者純培養(yǎng)時兩株菌的生長情況和菌中與群體感應或毒力因子相關(guān)的免疫基因的表達。結(jié)果得知,HC-2與VPE1共培養(yǎng)8小時后,培養(yǎng)液中VPE1的菌濃度顯著下降而HC-2的菌濃度變化趨勢與純培養(yǎng)時相一致。轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示,共培養(yǎng)8小時后,HC-2中l(wèi)uxS基因的表達量逐漸上升,說明LuxS或許參與到HC-2對VPE1的競爭排斥過程。有趣的是,熱失活的HC-2菌體可以顯著促進VPE1中的aphA、opaR和tlh的表達,該實驗結(jié)果表明,HC-2的胞內(nèi)成分在共培養(yǎng)時可以促進VPE1毒力相關(guān)因子的短期表達,這或許會增加對蝦感染弧菌的風險。最后,探討了戊糖乳桿菌HC-2在凡納濱對蝦感染弧菌前后的短期投喂對凡納濱對蝦存活率和腸道中相關(guān)免疫基因表達的影響。實驗結(jié)果顯示,凡納濱對蝦投喂益生菌后再浸浴在弧菌中的存活率高于對蝦感染弧菌后再投喂益生菌的存活率,但是差異不顯著。并且對蝦腸道相關(guān)免疫基因的表達情況也說明,當凡納濱對蝦受到弧菌的感染后,益生菌的添加對凡納濱對蝦內(nèi)在免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用,在一定程度上可以增強其對病原菌的抵抗力,但益生菌的短期投喂不能較好的提高凡納濱對蝦抵抗病原菌的能力。
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S968.22

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本文編號：1281913