發(fā)布時(shí)間：2017-12-12 15:41

  本文關(guān)鍵詞：牛奶中四種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留免疫檢測技術(shù)研究

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【摘要】：大環(huán)內(nèi)酯類(Macrolides, MALs)抗生素對葡萄球菌、鏈霉菌等大多數(shù)革蘭氏陽性菌和支原體具有突出的抗菌活性,在獸醫(yī)臨床上主要用于預(yù)防和治療畜禽呼吸道和消化道疾病,但由于MALs藥物可引起耳毒性和腎毒性等毒副作用,嚴(yán)重威脅人體健康,近年來在動(dòng)物性食品中的殘留問題日益引起國內(nèi)外的關(guān)注。本論文開展了MALs多殘留快速檢測的免疫分析方法研究,為動(dòng)物性食品中MALs殘留監(jiān)控提供技術(shù)支撐。本文制備了替米考星(Tilmicosin, TIM)多抗,其IC50值為1.1μg/L,對泰樂菌素(Tylosin, TYL)的交叉反應(yīng)率為45.8%。同時(shí),我們還探討了同源包被原和異源包被原對抗體靈敏度的影響。結(jié)果表明包被原的異源性與靈敏度有直接關(guān)系。建立了牛奶中MALs多殘留同時(shí)檢測的膠體金免疫層析方法。對膠體金標(biāo)記抗體體系、抗原包被體系、材料工藝體系、加樣方式等主要因素進(jìn)行了篩選和優(yōu)化；考察了膠體金快速檢測產(chǎn)品的區(qū)域樣本適應(yīng)性,低溫抗干擾能力,加速和長期穩(wěn)定性。該方法對紅霉素(Erythromycin, ERY)、螺旋霉素(Spiramycin, SPI)、TIM和TYL的cut-off值分別為5、5、10和20μg/L。牛奶樣本無需前處理,同步檢測四種藥物的時(shí)間在10 min以內(nèi),假陽性率和假陰性率均為0。長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明：MALs膠體金試紙條的有效期可達(dá)12個(gè)月。建立了牛奶中MALs多殘留同時(shí)檢測的熒光微球免疫層析方法。篩選適合標(biāo)記的熒光微球,對熒光微球標(biāo)記抗體體系、抗原包被體系、材料工藝體系、加樣方式等主要因素進(jìn)行優(yōu)化確定。研究了反應(yīng)體系的放大穩(wěn)定性、低溫抗干擾能力,加速和長期穩(wěn)定性。在紫外燈下肉眼觀察,該方法檢測牛奶中ERY、SPI、TIM、TYL的cut-off值分別為2.5、2.5、2.5和5μg/L。牛奶樣本簡單稀釋,同步檢測四種藥物的時(shí)間在20 min以內(nèi)。通過熒光信號讀數(shù)儀分析,該方法對牛奶中ERY、SPI、TIM和TYL的檢測限均為0.13 μg/L。 ERY、SPI和TIM在1.25-5μg/L添加水平的回收率分別在91.8-109.2%、89.6-114.4%和84.8-111.6%之間,變異系數(shù)分別在5.4-11.3%,7.9-15.7%和6.2-13.7%之間。TYL在2.5-10μg/L添加水平的回收率為85.8-115.2%,變異系數(shù)為8.5-14.9%。長期穩(wěn)定性試驗(yàn)表明,MALs熒光微球試紙條有效期可達(dá)12個(gè)月。建立了牛奶中四種MALs殘留檢測的ELISA試劑盒技術(shù)。對影響方法性能的各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。包括抗原、抗體的濃度,反應(yīng)時(shí)間、溫度,反應(yīng)體系pH值、離子濃度、有機(jī)溶劑、樣本前處理等。該方法對牛奶中ERY、SP1、TIM和TYL的檢測限分別為0.272、0.609、0.358和0.962μg/L。ERY、SPI、TIM和TYL在1.0-4.0μg/L添加水平的回收率分別在72.8-103.7%、75.3-106.8%、84.9-113.6%和75.2-105.7%之間,變異系數(shù)分別在5.4-11.8%、6.6-9.4%、3.7-10.3%和6.6-12.3%之間。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明：ELISA試劑盒在4℃條件下保存的有效期可達(dá)12個(gè)月。采用建立的膠體金免疫層析方法、熒光微球免疫層析方法和ELISA方法檢測20份牛奶盲樣,并與HPLC-MS/MS方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明,建立的三種免疫分析方法檢測結(jié)果與HPLC-MS/MS方法測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)(R2)均0.99,相關(guān)性良好,說明建立的免疫學(xué)方法準(zhǔn)確性高,可靠性好。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S859.84

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本文編號：1283066