發(fā)布時間：2017-12-14 15:05

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)形泰勒蟲裂殖體轉(zhuǎn)化細胞抑制性消減文庫的構(gòu)建及差異基因的鑒定

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【摘要】：環(huán)形泰勒蟲病(Tropical theileriasis)是由環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)寄生于牛淋巴細胞、巨噬細胞和紅細胞內(nèi)所引起的一種蜱傳性血液原蟲病。環(huán)形泰勒蟲及同屬的小泰勒蟲(T.parva)是截至目前已發(fā)現(xiàn)的唯一一類可使哺乳動物細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化(永生化)的真核生物,而且這類細胞轉(zhuǎn)化是可逆的,當(dāng)轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)的寄生蟲被抗泰勒蟲藥物布帕伐醌(Buparvaquone,BW720c)清除后,轉(zhuǎn)化細胞將恢復(fù)正常細胞的有限繁殖特性,進入凋亡程序。本研究利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)構(gòu)建環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染細胞與正常牛外周血單個核細胞(PBMCs)抑制性消減文庫,并對部分差異基因進行生物信息學(xué)、實時熒光定量PCR和Western blot分析,最終篩選環(huán)形泰勒蟲裂殖體基因及轉(zhuǎn)化細胞與宿主正常細胞之間的差異表達基因,為深刻理解環(huán)形泰勒蟲與宿主細胞相互作用的分子基礎(chǔ)、揭示環(huán)形泰勒蟲轉(zhuǎn)化細胞的機制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建了環(huán)形泰勒蟲裂殖體轉(zhuǎn)化細胞抑制性消減文庫,通過文庫序列測序,共獲得364條有效ESTs序列,片段大小主要分布在350~1200bp之間;將所獲ESTs進行BLASTn序列比對,最終獲得192條基因序列,其中來自環(huán)形泰勒蟲的序列60條(包括11條蟲體蛋白酶基因序列、10條膜蛋白基因序列、7條假設(shè)蛋白基因序列、5條凋亡相關(guān)蟲體蛋白基因序列、5條核糖體蛋白基因序列、4條細胞周期蛋白基因序列、4條蟲體抗原基因序列和14條蟲體其它基因序列)、�；�因序列131條(其中19條為腫瘤相關(guān)蛋白基因序列)和1條未知序列。2.通過對文庫中環(huán)形泰勒蟲裂殖體基因進行克隆測序,最終獲得13條全長CDS序列;利用Protfun、Signa l P3.0、TMHMM 2.0和Lasergene(protean)生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析:Ta65、Ta129和Ta513蛋白存在較多的抗原表位,可用于后續(xù)診斷抗原或疫苗研制;Ta129、Ta511和Ta513可能具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)運等功能,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。3.使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計18S r RNA、GAPDH、ACTB、PRKG1和TBP 5個牛內(nèi)參基因的Real-time PCR引物,以環(huán)形泰勒蟲裂殖體轉(zhuǎn)化細胞和非感染牛PBMCs為試驗材料,對引物特異性、標準曲線、擴增效率分析,并利用ge Norm和Norm Finder進行綜合評價;結(jié)果發(fā)現(xiàn),5個內(nèi)參基因的擴增效率介于81.2~120.1%,且特異性均較好;18S r RNA和GAPDH具有良好的線性擴增;ge Norm和Norm Finder分析均發(fā)現(xiàn)18S r RNA為最穩(wěn)定內(nèi)參基因;綜合以上結(jié)果,最終確定18S r RNA作為最穩(wěn)定內(nèi)參基因,可用于環(huán)形泰勒蟲裂殖體轉(zhuǎn)化細胞中信號通路的研究。4.對環(huán)形泰勒蟲裂殖體轉(zhuǎn)化細胞差異基因進行Real-time PCR分析;結(jié)果顯示:宿主細胞腫瘤相關(guān)基因TFG、HCLS1和SENP5在轉(zhuǎn)化細胞中的轉(zhuǎn)錄水平分別是非轉(zhuǎn)化細胞的2.74、2.06和1.32倍;環(huán)形泰勒蟲裂殖體蛋白基因Ta65(TA08105)和Ta129(TA20380)在環(huán)形泰勒蟲裂殖體階段的轉(zhuǎn)錄水平分別是裂殖子(紅細胞內(nèi)寄生階段)階段的2.10和2.08倍。5.利用BW720c作用環(huán)形泰勒蟲轉(zhuǎn)化細胞,殺死蟲體,再利用Real-time PCR和Western blot方法檢測宿主腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達情況。結(jié)果顯示:相比對照組,在BW720c藥物處理組中,宿主腫瘤相關(guān)基因HCLS1和TFG的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降;宿主腫瘤相關(guān)蛋白TFG在藥物作用72h時,蛋白表達量有顯著下降;綜合以上結(jié)果說明,TFG蛋白在轉(zhuǎn)化細胞中的表達量與環(huán)形泰勒蟲的寄生直接相關(guān);該試驗結(jié)果為進一步研究環(huán)形泰勒蟲與宿主細胞相互作用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.7

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