發(fā)布時間：2017-12-14 15:14

  本文關鍵詞：紫黑翼蚌養(yǎng)殖基礎生物學特性與鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育研究

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【摘要】：淡水蚌類是指軟體動物門、雙殼綱、蚌目的種類,它們起源于大約1億年前,在漫長的進化演變過程中形成了豐富的生態(tài)和物種多樣性。目前,現(xiàn)存的淡水蚌類約840種,除南極地區(qū)外世界各個地區(qū)均有分布。它們不僅在維護淡水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用,而且自遠古時代就為人們所利用,具有十分重要的經(jīng)濟價值,主要包括食用、工藝品和培育珍珠等。紫黑翼蚌(紫黑翼蚌(Potamilus alatus )原產(chǎn)于北美洲,隸屬于蚌科、Lampsilinae亞科,為大型淡水貝類。在天然水域中紫黑翼蚌能產(chǎn)生天然的紫黑珍珠,人工插珠試驗表明:紫黑翼蚌是培育優(yōu)質紫黑珍珠的優(yōu)良品種。為在我國發(fā)展紫黑珍珠養(yǎng)殖,2012年淡水漁業(yè)研究中心從美國引進一批紫黑翼蚌幼蚌,在國內(nèi)開展人工馴養(yǎng)研究。由于紫黑翼蚌在北美為穩(wěn)定物種,基礎生物學研究甚為薄弱,且尚未有人工養(yǎng)殖,這給我國開展人工馴養(yǎng)帶來極大困難。另一方面,紫黑翼蚌鉤介幼蟲需要寄生在特定的寄主魚——淡水石首魚(Aplodinotus grunnens)才能完成寄生變態(tài)發(fā)育,從而實現(xiàn)苗種的人工繁育。由于國內(nèi)沒有淡水石首魚,嚴重制約了我國紫黑翼蚌苗種的人工繁育和紫黑珍珠產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進程。本文以引進的紫黑翼蚌幼蚌開展養(yǎng)殖基礎生物學特性與鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育研究,為實現(xiàn)紫黑翼蚌人工養(yǎng)殖與繁育提供理論依據(jù)和技術支撐,對我國淡水珍珠養(yǎng)殖品種結構調(diào)整和可持續(xù)發(fā)展具有重要價值和意義。本研究主要包括以下6個部分:1紫黑翼蚌在人工養(yǎng)殖條件下的生長與形態(tài)特征在ISC模式下,1 ～ 3齡紫黑翼蚌體重生長呈現(xiàn)明顯周年季節(jié)變化特征,4～10月為快速生長期,11月～奕年3月為緩慢增長期,呈現(xiàn)明顯的“快-慢”交替規(guī)律;在1～2齡階段,殼長、殼高及殼寬生長趨勢與體重相似,而2～3齡階段均為平緩生長期;貝殼存在一定的異速生長,2齡殼寬增長率最高,3齡殼高增長率最高。Logistic模型為紫黑翼蚌殼長生長的最佳擬合模型。比較了兩種養(yǎng)殖模式對紫黑翼蚌成活和生長的影響。在SPC模式下,15個月馴養(yǎng)成活率(98.6 ± 2.9% )顯著高于ISC模式(85.0 ± 5.0% );自2齡起,SPC組蚌平均體重、殼長、殼高、殼寬及月增長率均顯著高于ISC組;紫黑翼蚌馴養(yǎng)死亡主要出現(xiàn)在6～8月高溫期間,可能是高水溫與高氨氮及亞硝酸鹽等協(xié)同作用結果;紫黑翼蚌適宜的生長水溫為18.7 ～31.5℃C,且對低溫有較強的適應能力。通過個體標記跟蹤比較了紫黑翼蚌雌雄形態(tài)和生長差異,結果表明:兩性異形和體重、殼長、殼高及殼寬差異均出現(xiàn)在2齡初次性成熟前后;雌蚌雙殼后端逐步變寬直而膨脹,可能有利于育兒囊內(nèi)胚胎的發(fā)育。在SPC模式下,2齡雄蚌體重、殼長分別高于雌蚌41.5%、16.7%,3齡雄蚌分別高44.0%、15.1%,雄蚌更適宜作為紫黑珍珠培育的受體蚌;兩種養(yǎng)殖模式對雌雄形態(tài)分化影響不大,對雌雄體重和殼長生長差異表現(xiàn)時間無顯著影響,但在ISC模式下雌雄殼高、殼寬出現(xiàn)差異的時間延遲。2紫黑翼蚌幼蚌足絲分泌特性與微結構研究與我國淡水蚌類不同,紫黑翼蚌在幼蚌早期生長階段能分泌形成暫時性足絲。在殼長5 ～ 30mm階段,隨著殼長增長,分泌足絲的幼蚌比例逐步下降,而殼長30mm以上的幼蚌停止分泌。底質類型顯著影響幼蚌足絲分泌,但足絲分泌速率存在明顯的個體差異。對足絲微結構觀察顯示:足絲主要由足絲線、足絲柄及足絲盤組成。若干足絲盤通過足絲柄沿足絲線隨機鏈接分布。足絲線外部由一層均質的足絲膜覆蓋,內(nèi)部由4股初級纖維形成右手螺旋結構,而初級纖維由大量平行排列的直徑5μm的二級纖維組成。足絲盤底部具有較高的粘性,在水下可牢固粘附在砂礫等底質上。當受到外力拉伸后,足絲線可發(fā)生較大的彈性形變,但足絲膜先于內(nèi)部纖維發(fā)生斷裂。幼蚌的足絲與海水貽貝足絲的微結構和氨基酸組成均存在顯著差異,其獨特的結構在早期幼蚌的生存、遷移和聚集上具有重要作用。本研究首次報道了紫黑翼蚌的暫時性足絲分泌特性和微結構,并探討了與生長發(fā)育的關系,為進一步開展早期幼蚌規(guī)�；�培育提供重要理論依據(jù)。3人工養(yǎng)殖紫黑翼蚌的繁殖生物學研究在江蘇地區(qū)紫黑翼蚌養(yǎng)殖種群在2齡達到初次性成熟,未發(fā)現(xiàn)明顯的性別偏離。9月早期至10月份為雌雄蚌交配盛期,在10月初即可達到成熟,而自然排放主要在翌年4 ～ 5月份,為長期孵育類型(Bradytictic )。雌蚌性成熟最小殼長58.5 mm ,懷幼量在2860 ～ 37400 ,與養(yǎng)殖模式及母蚌的體重等密切相關,但顯著少于我國常見的大型蚌類的懷幼量。在人工養(yǎng)殖條件下,紫黑翼蚌的繁殖周期與阿拉巴馬州的野生種群相似,而與更高緯度的威斯康辛州野生種群有較大差異,這可能主要與生長發(fā)育的積溫差異有關。紫黑翼蚌受精卵為長橢圓形,隨著胚胎發(fā)育時序,卵黃囊逐步被胚體吸收而縮小,(?)胚體逐步增大,但胚體并不包裹卵黃囊吸收營養(yǎng),這種特殊的營養(yǎng)供給方式與我國的蚌類完全不同。依據(jù)卵黃囊的大小、胚體形態(tài)及運動等顯著發(fā)育特征,將原先統(tǒng)稱為鉤介幼蟲期進一步劃分為肌肉效應期、閉殼肌形成期、雙殼成形期、雙殼開合期及破膜期。形態(tài)學觀察表明:成熟鉤介幼蟲為斧頭型,雙殼左右對稱,但大小略有差異;腹緣具有2對膠質的殼鉤和成排的乳突,在幼蟲寄生過程中具有重要作用;外套膜游離面為柱狀細胞,內(nèi)部具有3對左右對稱分布的感覺毛,1對位于近腹緣,2對分別位于閉殼肌附近。4紫黑翼蚌母系與父系線粒體基因組比較及系統(tǒng)發(fā)育分析基因擴增表明:紫黑翼蚌體內(nèi)存在兩類完全不同線粒體,為明顯的單雙親遺傳(DUI )。母系(F型)線粒體基因組長度為16 067bp ,父系(M型)為16 560bp,比F型長493bp。兩類線粒體均含有37個常規(guī)基因。在F型和M型線粒體中分別發(fā)現(xiàn)1個雌性開放閱讀框(forf)和雄性開放閱讀框(morf);基因組均具有明顯的(A+T )堿基偏向(F = 61% , M = 62.2% )。 37個基因排序差異主要是tRNAs與兩個ORFan基因的位置存在較大不同。M型線粒體基因具有144 bp的cox2延長(cox2e ),顯著短于已報道的蚌類531～～576bp差異,這種較短的Mcox2e可能是Potamilus屬物種線粒體基因組的共同進化特征。以23個蚌類線粒體基因組序列(包括紫黑翼蚌)重建了其系統(tǒng)發(fā)育樹,結果表明:蚌類F型和M型為并系,進化關系顯示:DUI起源先于蚌科的物種形成之前,也先于蚌科和珠蚌科物種分化;紫黑翼蚌與Leptodealeptodon的親緣關系更為接近,這與兩者具有十分相似的生物學特性相吻合。已有近緣種的生物學研究也對我國紫黑翼蚌的人工養(yǎng)殖和繁育具有重要參考價值。5紫黑翼蚌鉤介幼蟲寄主魚的人工篩選選取16種代表性魚類對紫黑翼蚌鉤介幼蟲寄主魚進行人工篩選試驗結果表明:僅在淡水石首魚上獲得變態(tài)發(fā)育的稚蚌,寄生變態(tài)率為49.6% ,過量寄生可能是導致淡水石首魚死亡的重要原因。掃描電鏡觀察顯示:鉤介幼蟲可在眼斑擬石首魚鰓絲寄生并形成完整的包囊,且在大規(guī)格魚體形成包囊的速度明顯快于幼魚,表明眼斑擬石首魚具有用作替代寄主魚的潛力;但在寄生和淡水低滲雙重脅迫下,眼斑擬石首魚寄生后出現(xiàn)極高的死亡率,應進一步開展淡化處理和營養(yǎng)強化培育,提高其寄生魚的暫養(yǎng)成活率。與其他魚類相比,在黃顙魚、小口鱸魚、藍鯰魚寄生后1～2d內(nèi)脫落的幼蟲幾乎全部死亡,推測3種魚體中可能存在紫黑翼蚌幼蟲的致死因子,這與后期的黃顙魚血漿對幼蟲的體外培養(yǎng)試驗結果相符。綜合結果表明:紫黑翼蚌是目前發(fā)現(xiàn)對寄主魚選擇性最為專一的蚌類。6紫黑翼蚌鉤介幼蟲的非寄生變態(tài)發(fā)育研究比較了改進的體外培養(yǎng)技術和傳統(tǒng)方法對紫黑翼蚌鉤介幼蟲非寄生變態(tài)發(fā)育的影響。進一步以改進的體外培養(yǎng)技術,從14種血漿(或血清)中篩選出了紫黑翼蚌鉤介幼蟲體外培養(yǎng)高效配方,首次成功實現(xiàn)斧頭型鉤介幼蟲的非寄生變態(tài)發(fā)育。結果表明:添加不同血漿(血清)對紫黑翼蚌的鉤介幼蟲變態(tài)發(fā)育具有顯著差異,黃顙魚、大口黑鱸、大鱗渻、雜交鱘及兔血清組幼蟲全部死亡,而其他9組幼蟲培養(yǎng)20d的成活率在12.4% ～ 98.3%之間,僅瓜子斑和眼斑擬石首魚組能使幼蟲完成變態(tài)發(fā)育,瓜子斑組幼蟲變態(tài)率最高(93.3 ± 3.1% ),顯著高于海水與淡化眼斑擬石首魚組。不同孕育時期的孕育蚌幼蟲變態(tài)率存在顯著差異,變態(tài)率所孵育時間增加而逐步下降,可能與孕育蚌的營養(yǎng)供給有關。2倍傳統(tǒng)混合抗生素濃度對幼蟲變態(tài)發(fā)育具有明顯抑制和致死作用,表明紫黑翼蚌對混合抗生素較為敏感。添加不同比例瓜子斑和鯉魚混合血漿對幼蟲變態(tài)發(fā)育具有明顯差異:隨著鯉魚血漿添加比例增加,幼蟲變態(tài)率、稚蚌活力顯著下降,而外殼生長速度和稚蚌畸形發(fā)育比例明顯增加;保存11月與新制備的瓜子斑血漿對幼蟲變態(tài)率無顯著差異,但前者變態(tài)畸形率顯著升高(P=0.003) 其畸形稚蚌與鯉魚組相似。表明鯉魚血漿中存在促進幼蟲外殼生長的重要營養(yǎng)因子,而缺乏促進幼蟲內(nèi)臟發(fā)育的關鍵營養(yǎng)因子;瓜子斑血漿中存在較高含量促進幼蟲內(nèi)臟包括斧足發(fā)育的關鍵營養(yǎng)因子,且隨著凍存時間會明顯下降。在添加瓜子斑血漿的培養(yǎng)液中,24℃條件下,幼蟲在20d完成變態(tài)發(fā)育成稚蚌。在變態(tài)發(fā)育過程中,不僅要完成內(nèi)臟組織器官的分化,其外殼增長約2～3倍,為內(nèi)臟器官的分化與生長提供了更大的空間。在培養(yǎng)早期,幼蟲外套膜細胞逐步增厚形成蘑菇體細胞,使雙殼封閉;新殼從前后端逐步生長成近圓形;在培養(yǎng)中期至后期,內(nèi)部斧足板、鰓板、內(nèi)臟組織及閉殼肌等逐步形成,最終變態(tài)形成依靠斧足自由爬動的稚蚌。對血漿主要生化指標測定分析表明:與其他魚類相比,瓜子斑血漿具有低血糖和甘油三酯、高蛋白、膽固醇和脂蛋白的特點,可能是幼蟲具有高變態(tài)率的重要原因。進一步對FAA比較測定分析表明:常見20種氨基酸雖有一定差異,但與L-15基礎培養(yǎng)液相比,其含量極低,對培養(yǎng)液配方中含量無顯著影響。鯉魚血漿的�；撬岷�量顯著高于其他3種魚類,分別是瓜子斑的9.1倍、眼斑擬石首魚的3.6倍。高濃度的�；撬崾俏ㄒ豢赡艽龠M幼蟲外殼快速生長的氨基酸因子。對血漿脂肪酸組成比較分析推測:培養(yǎng)液中缺乏足夠量的DPA和DHA可能是紫黑翼蚌幼蟲斧足及內(nèi)臟異常發(fā)育的重要原因之一。黃顙魚、大鱗渻血漿熱滅活處理后對幼蟲變態(tài)發(fā)育具有明顯影響。未滅活組幼蟲在培養(yǎng)24h全部開口腐爛死亡,而黃顙魚、大鱗渻血漿滅活組幼蟲在培養(yǎng)10d存活率分別為82%、55% ,且黃顙魚漿滅活組外殼生長明顯,而大鱗渻組幼蟲外殼生長差異較大。對比黃顙魚、大鱗渻、瓜子斑及眼斑擬石首魚血漿滅活前后的8種非特異性免疫指標變化,結果表明血漿中溶菌酶、干擾素、補體C3、C4、IgG、IgM、α-HBDH及ALP并非是幼蟲的致死因子。這種紫黑翼蚌幼蟲致死因子可能普遍存在魚體中,可能是魚類對蚌類鉤介幼蟲寄生的第一道天然防御屏障。
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
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本文編號：1288364