發(fā)布時(shí)間：2017-12-14 23:17

  本文關(guān)鍵詞：小麥赤霉�、蛐涂剐詸C(jī)理研究及相關(guān)基因的功能鑒定

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【摘要】：小麥赤霉病抗源極其有限,抗性種質(zhì)以II型(抗延展型)抗性為主。雖然前人對(duì)其抗病機(jī)理研究已經(jīng)開展了大量工作,但是由于其本身的復(fù)雜性,目前對(duì)小麥赤霉病II型抗性的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。本研究以最具代表性的赤霉病II型抗性小麥品種蘇麥3號(hào)為研究材料,首先對(duì)禾谷鐮刀菌侵染小穗不同階段取材進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)定,并以此為研究基礎(chǔ),分析赤霉病II型抗性的抗病機(jī)理,發(fā)掘抗病相關(guān)的抗病路徑,并結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其關(guān)鍵調(diào)控基因進(jìn)行驗(yàn)證。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.接菌處理后0h、12h、24h、48h、72h和96h,分別取接菌穗及相鄰穗軸進(jìn)行RNA提取及cDNA文庫(kù)構(gòu)建,并通過Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。利用中國(guó)春的基因注釋文件作為參考基因組,使用Hisat、Htseq和DEseq等分析軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較,尋找禾谷鐮刀菌處理不同時(shí)間后的差異表達(dá)基因。以Pval0.05作為顯著差異表達(dá)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)處理不同時(shí)間材料之間的差異表達(dá)基因平均有2287個(gè),而且不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因的數(shù)目存在很大差異。通過GO注釋與富集、KEGG分析以及Mapman對(duì)差異基因進(jìn)行可視化處理。發(fā)現(xiàn)小麥在受到禾谷鐮刀菌侵染后,細(xì)胞壁合成修飾及降解、光合作用、磷酸化、糖代謝途徑、激素代謝和信號(hào)傳導(dǎo)以及去毒化過程的一些基因受到顯著調(diào)控。其中SA和JA激素合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑分別在禾谷鐮刀菌侵染前期和后期受到顯著調(diào)控,對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)通路上關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),SA和JA均對(duì)小麥赤霉病產(chǎn)生響應(yīng),但是SA主要在禾谷鐮刀菌侵染0-24h產(chǎn)生響應(yīng),而JA對(duì)赤霉病的響應(yīng)時(shí)間晚于SA。2.為了驗(yàn)證SA和JA信號(hào)通路參與赤霉病抗病過程,本實(shí)驗(yàn)對(duì)小麥穗部和葉片分別進(jìn)行了外源激素處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外源施加SA和MeJA可以提高小麥穗部赤霉病抗病能力,其中在感病材料中更加明顯;SA處理小麥葉片后,葉片的抗病能力提高,但是,MeJA處理反而降低了葉片對(duì)禾谷鐮刀菌的抵抗能力。說明,SA可以提高小麥植株的整體赤霉病抗性,而JA在小麥穗部和葉片可能存在不同的調(diào)控機(jī)制。3.NPR1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在模式植物中已經(jīng)驗(yàn)證為SA信號(hào)通路關(guān)鍵調(diào)控因子。為了明確SA和JA交叉反應(yīng)及其在赤霉病抗性中的作用,本研究對(duì)小麥NPR1基因進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小麥中TaNPR1可以受到禾谷鐮刀菌的正向調(diào)控,與JA信號(hào)通路的趨勢(shì)一致。而外源激素處理進(jìn)一步證實(shí)其受JA調(diào)控,不受SA響應(yīng)。另外,其同源基因TaNPR2和TaNPR3可以受SA和JA激素的雙重調(diào)控。說明,NPR1在雙子葉植物中參與了不同于單子葉植物的調(diào)控路徑,而且,SA和JA信號(hào)傳導(dǎo)路徑在單子葉和雙子葉植物中存在不同的調(diào)控機(jī)制。4.為了進(jìn)一步確認(rèn)SA和JA的抗赤霉病功能,本研究利用BSMV-VIGS體系在小麥穗部對(duì)SA生物合成及信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)鍵基因TaNPR1、TaOPR3和TaICS1等進(jìn)行沉默并進(jìn)行抗病性鑒定,結(jié)果表明TaOPR3和TaICS1基因被沉默后小麥的赤霉病抗性與空載對(duì)照相比顯著降低,發(fā)病小穗數(shù)明顯增多;而沉默TaNPR1基因后小麥赤霉病抗性沒有發(fā)生很大的變化,說明SA能夠顯著提高小麥赤霉病抗性,而TaNPR1基因可能不參與小麥的SA信號(hào)通路,而是通過其他信號(hào)路徑發(fā)揮抗病作用。5.為進(jìn)一步深入研究SA的功能,本研究對(duì)禾谷鐮刀菌侵染小麥過程進(jìn)行了ROS染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)接菌處理可以誘導(dǎo)接菌小穗ROS的產(chǎn)生,造成接菌穗的HR反應(yīng),從而抑制病原菌的萌發(fā)和蔓延,提高小麥對(duì)赤霉病的抗延展能力。6.DON是一種由赤霉菌產(chǎn)生的真菌毒素,它可以促進(jìn)病原菌在植物體內(nèi)的擴(kuò)散。UGT家族成員能夠?qū)⒂坞x態(tài)的DON轉(zhuǎn)變成低毒力的D3G,但是目前還很少在小麥抗赤霉病研究中見到此類報(bào)道。本研究中根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)病原菌侵染后期大量的UGT基因被誘導(dǎo)表達(dá),根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)在抗赤霉病小麥品種中特異表達(dá),而且對(duì)DON和禾谷鐮刀菌產(chǎn)生強(qiáng)烈響應(yīng)的UGT家族成員TaUGT5。該基因擁有一個(gè)1431bp的ORF,可以編碼476個(gè)氨基酸殘基;利用中國(guó)春缺-四體材料將其定位于2B染色體;在中國(guó)春參考基因組A、B和D染色體組分別存在一個(gè)等位基因,但是只有2B染色體上的基因能夠表達(dá);過表達(dá)TaUGT5轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)DON毒素表現(xiàn)出較高的耐受性;在小麥中過表達(dá)TaUGT5,轉(zhuǎn)基因植株的胚芽鞘抗赤霉病鑒定結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株能夠有效地抑制禾谷鐮刀菌在胚芽鞘的蔓延速度;但是穗部和葉片的鑒定結(jié)果對(duì)赤霉病的抗性沒有在胚芽鞘中表現(xiàn)的那么明顯。亞細(xì)胞定位研究將TaUGT5編碼蛋白定位于細(xì)胞膜上,這可能與TaUGT5的生物學(xué)功能有關(guān),該基因的編碼蛋白能夠減少DON毒素對(duì)細(xì)胞膜的損害,保持細(xì)胞穩(wěn)定性,從而降低赤霉菌在植物組織中的蔓延速度。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.121.45
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本文編號(hào)：1289708