發(fā)布時(shí)間：2018-04-09 04:31

  本文選題：大墊尖翅蝗　切入點(diǎn)：丁烯氟蟲腈　出處：《沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：大墊尖翅蝗Epacromius coerulipes Ivanov是北方草原的優(yōu)勢(shì)種蝗蟲,分布廣泛,為害嚴(yán)重,成蟲還有短距離飛翔能力,可以進(jìn)行遷移危害,對(duì)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)蝗蟲的治理仍以化學(xué)農(nóng)藥為主,致使蝗蟲對(duì)常用化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性,防治效果下降,蝗災(zāi)不斷爆發(fā)。新型殺蟲劑丁烯氟蟲腈作為蝗蟲防治的應(yīng)急藥劑得到了廣泛的應(yīng)用。為了了解田間大墊尖翅蝗對(duì)各種常用殺蟲劑的抗性發(fā)生發(fā)展情況,延長(zhǎng)藥劑的使用壽命,對(duì)蝗蟲進(jìn)行抗性檢測(cè)、研究蝗蟲對(duì)丁烯氟蟲腈抗性發(fā)生的機(jī)理對(duì)于草原蝗蟲的抗性治理和可持續(xù)治理具有重要的意義。本文以北方優(yōu)勢(shì)種蝗蟲大墊尖翅蝗為研究對(duì)象,在建立殺蟲劑敏感基線的基礎(chǔ)上通過田間抗藥性檢測(cè),丁烯氟蟲腈抗性篩選及抗性現(xiàn)實(shí)遺傳力研究,分析了大墊尖翅蝗對(duì)10種殺蟲劑的抗藥性發(fā)展動(dòng)態(tài)及對(duì)丁烯氟蟲腈抗性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)利用敏感品系和丁烯氟蟲腈抗性品系蝗蟲測(cè)定解毒酶活力,分析其抗性產(chǎn)生的生化機(jī)制;利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組信息,鑒定分析與殺蟲劑抗性相關(guān)的基因和功能以及差異表達(dá)情況,然后將篩選出的與抗性密切相關(guān)的超表達(dá)的P450、GSTs和CarE基因利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行定量驗(yàn)證。具體研究結(jié)果如下：一、大墊尖翅蝗對(duì)10種殺蟲劑的敏感基線構(gòu)建和田間抗藥性檢測(cè)采集于天然草原的大墊尖翅蝗,經(jīng)過繼代培養(yǎng)后利用點(diǎn)滴法進(jìn)行毒力測(cè)定,建立了10種殺蟲劑對(duì)大墊尖翅蝗的敏感基線。并以此為基準(zhǔn)分別在2010年和2013年對(duì)大慶周圍草原三個(gè)不同地點(diǎn)的大墊尖翅蝗抗性情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明：大墊尖翅蝗對(duì)菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了低水平抗性,抗性倍數(shù)在5.07～9.41之間；對(duì)辛硫磷的敏感性下降,其他藥劑均很敏感。同時(shí)抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果也表明,在害蟲抗性水平較低的情況下停止用藥,害蟲會(huì)在很短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)對(duì)藥劑的敏感性。在菊酯類農(nóng)藥中混用PBO或在辛硫磷殺蟲劑中混用TPP,對(duì)殺蟲劑均表現(xiàn)出明顯的增效作用�？梢�,該研究為蝗蟲抗性治理和綜合治理提供藥劑的選擇和應(yīng)用的指導(dǎo),對(duì)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)具有一定的實(shí)踐意義。二、抗丁烯氟蟲腈大墊尖翅蝗的選育及抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估利用丁烯氟蟲腈對(duì)大墊尖翅蝗進(jìn)行連續(xù)7代的篩選,抗性增加到11.74倍。從抗性選育的過程看,連續(xù)篩選的前4代抗性增長(zhǎng)較慢,到F5代抗性增長(zhǎng)加快。通過7代的大墊尖翅蝗抗性的現(xiàn)實(shí)遺傳力的評(píng)估,h2=0.3191。同時(shí),推算田間條件下大墊尖翅蝗對(duì)丁烯氟蟲腈抗性倍數(shù)提高10倍需要12～25代,由于大墊尖翅蝗在北方一年僅發(fā)生一代,可見抗性風(fēng)險(xiǎn)并不高。三、大墊尖翅蝗對(duì)丁烯氟蟲腈抗性的生化機(jī)制利用活體增效試驗(yàn)和解毒酶活力測(cè)定方法,對(duì)大墊尖翅蝗丁烯氟蟲腈抗性發(fā)生的生化機(jī)理進(jìn)行了研究。酶活性測(cè)定結(jié)果表明：抗性品系中三種解毒酶的活性均顯著升高,其中多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活性分別是敏感品系的4.04倍、1.94倍和1.34倍。同時(shí),經(jīng)過丁烯氟蟲腈不同劑量誘導(dǎo)后,多功能氧化酶和酯酶在抗感品系中都得到顯著誘導(dǎo),谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶僅在抗性品系中誘導(dǎo)顯著。增效劑試驗(yàn)結(jié)果表明：PBO對(duì)抗感試蟲的增效作用最顯著,TPP次之。而DEM則僅對(duì)抗性品系表現(xiàn)出增效作用。綜合分析認(rèn)為多功能氧化酶活性增強(qiáng)在抗性形成中發(fā)揮的作用較大。但是酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶也都可能是大墊尖翅蝗對(duì)丁烯氟蟲腈抗性產(chǎn)生的因素之一四、大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序利用Illumina/Solexa HiseqTM 2500二代測(cè)序平臺(tái),在無(wú)參考基因組下對(duì)大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得13.4 G原始數(shù)據(jù)并組裝成63,033條unigenes,平均長(zhǎng)度為772 bp和N50為1589bp。共計(jì)有25,132條unigenes被成功注釋,占大墊尖翅蝗總unigenes數(shù)目的39.87%。KEGG分析,7,218 unigenes形成218代謝或信息通路。其中,266 unigenes參與外源性物質(zhì)或藥物的代謝途徑。此外,5,696簡(jiǎn)單序列重復(fù)被檢測(cè)到。該轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析為進(jìn)一步研究大墊尖翅蝗殺蟲劑的抗藥性機(jī)制及基因功能分析奠定了分子基礎(chǔ)。五、差異表達(dá)基因分析利用大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù),比較了PS和PR兩個(gè)品系的基因表達(dá),并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO、Pathways顯著富集分析。結(jié)果表明：2,568條差異表達(dá)基因中有1,646條上調(diào),922條下調(diào)。G0顯著富集分析表明細(xì)胞組分中顯著富集的有61條DEGs;生物學(xué)過程顯著富集的有150條DEGs,分子功能顯著富集的127條DEGs中,氧化還原酶活性基因序列有37條,其表達(dá)量上調(diào)23條,下調(diào)14條,有5條序列在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋為P450基因。利用topGO軟件對(duì)注釋到G0數(shù)據(jù)庫(kù)的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,分子功能中顯著富集的節(jié)點(diǎn)600052689具有羧酸水解酶活性,4條注釋為羧酸酯酶,且高表達(dá)說明該節(jié)點(diǎn)參與殺蟲劑的代謝過程。COG分類中,Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism差異表達(dá)基因數(shù)量達(dá)到28條,占總數(shù)2.98%,比例提高。KEGG注釋中,差異基因分布在130個(gè)代謝通路中。其中核糖體Ribosome,淀粉和蔗糖代謝Starch and sucrose metabolism,抗壞血酸和代謝Ascorbate and aldarate metalolism,借助細(xì)胞色素p450藥物代謝Drug metabolism-cylochrome p450,外源物質(zhì)p450代謝Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450,糖酵解/糖的異生Glycolysis/Gluconeogenesis,谷胱甘肽代謝Glutathione metabolism 7個(gè)通路富集程度最高。其中Drug metabolism-cylochromeP450、Metabolism of xenobiotics by cytochrome p450和Glutathione metabolism三條代謝通路是殺蟲劑代謝最重要的路徑,對(duì)大墊尖翅蝗的研究發(fā)現(xiàn)有23條差異基因(上調(diào)11條,下調(diào)12條)注釋到這三條代謝通路中。從代謝通路圖中發(fā)現(xiàn)與上調(diào)基因有關(guān)的蛋白有很多,其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[EC：2.5.1.18]在三條代謝通路圖中都有上調(diào)的表現(xiàn),且出現(xiàn)頻率最高。還有大量的脫氫酶和轉(zhuǎn)移酶在代謝通路中上調(diào)。這些酶都有可能參與蝗蟲對(duì)殺蟲劑的代謝降解作用�？梢娺@些基因和蛋白是后續(xù)基因功能研究和代謝通路研究的基礎(chǔ)。六、殺蟲劑抗性相關(guān)基因的注釋和分類在大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組信息中篩選與殺蟲劑抗性相關(guān)的基因序列,結(jié)果顯示316條編碼p450、CarE和GSTs三大解毒酶的基因被注釋,76條編碼殺蟲劑目標(biāo)蛋白的基因被注釋。G0數(shù)據(jù)庫(kù)注釋顯示,213 unigenes被確認(rèn)為可能參與外源性物質(zhì)的解毒,34條unigenes被確定為編碼殺蟲劑目標(biāo)蛋白質(zhì)。對(duì)這些解毒酶基因及靶蛋白基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,有AT、AC、AG、GT、CG、CT類型,共計(jì)416個(gè)SNP位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)�？梢酝ㄟ^這些SNP位點(diǎn)來(lái)挖掘和發(fā)現(xiàn)抗性相關(guān)的基因突變。針對(duì)大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,與已知基因組信息的物種進(jìn)行比對(duì),采用NJ法構(gòu)建p450、CarE、GSTs的系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示58條p450基因分屬于14個(gè)CYP家族,52條CarE分屬于5個(gè)家族,24條GSTs被劃分為GSTs的六個(gè)家族和Micromal。這些解毒酶的大部分基因家族在C0和COG數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋均顯示可代謝殺蟲劑。同時(shí)這些解毒酶基因中有48條差異表達(dá)(23條上調(diào),25條下調(diào))。這些差異基因?qū)⑹沁M(jìn)一步研究抗性發(fā)生機(jī)理的主要候選基因。七、超表達(dá)解毒酶基因的定量檢測(cè)選擇大墊尖翅蝗轉(zhuǎn)錄組中與殺蟲劑代謝相關(guān)的顯著上調(diào)表達(dá)的解毒酶基因序列,利用RT-PCR技術(shù),以GAPDH為內(nèi)參基因,通過比較CT值法檢測(cè)其在PS和PR兩品系中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示,在PR品系中5條p450、3條CarE、3條GSTs序列的表達(dá)量均高于PS品系,且大部分達(dá)到極顯著水平。以上結(jié)果首先證明差異表達(dá)基因的RT-PCR檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果較一致,即表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確度和可信度較高,可以以此為基礎(chǔ)進(jìn)行分子生物學(xué)的相關(guān)研究。其次,更進(jìn)一步確定了這些解毒酶基因在大墊尖翅蝗抗性品系中超表達(dá)。結(jié)合前面的生化機(jī)理分析,在分子水平上也同樣證明大墊尖翅蝗對(duì)丁烯氟蟲腈的抗藥性,與p450、CarE、GSTs三種解毒酶過量表達(dá)關(guān)系密切。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S433.2
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本文編號(hào)：1724880