發(fā)布時間：2018-04-10 17:52

  本文選題：ZIP11 + 肉雞��； 參考：《四川農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：鋅是機體必需的微量元素,機體需要準確地調(diào)節(jié)鋅穩(wěn)態(tài)平衡,讓鋅水平維持在正常的范圍內(nèi)。機體的鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控主要是由鋅轉運蛋白ZNT與ZIP家族負責。ZIP11則是ZIP家族全新的基因,之前尚未見關于ZIP11功能的研究報道。由沙門氏菌污染禽肉引起的人食源性疾病仍然是世界衛(wèi)生組織面臨的主要問題之一。肉雞大腸桿菌感染或內(nèi)毒素刺激均會出現(xiàn)典型的“低鋅血癥”,血清鋅降低,肝臟鋅升高；同時多項研究暗示病原微生物感染可能會影響機體先天免疫細胞(如中性粒細胞與巨噬細胞)的鋅穩(wěn)態(tài)。但沙門氏菌感染對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響與調(diào)控機理目前仍不清楚。鋅轉運蛋白在其中的作用也是未知,ZIP11是否參與其中有待研究。本研究將全面系統(tǒng)地回答這些問題,共開展以下三項研究：實驗一：ZIP11在機體鋅代謝中的作用與機理研究本研究以野生型小鼠與細胞系為模型,全面系統(tǒng)地研究ZIP11在機體鋅代謝中的作用與機理。首先通過生物信息學分析ZIP家族在真核上的分布規(guī)律與進化關系,從不同的真核生物類群(如哺乳動物、脊椎動物、植物與原生動物等)中挑選了25種具有代表性的真核生物的ZIP基因進行分析。結果發(fā)現(xiàn),ZIP11是ZIP家族gufA亞家族的唯一成員,起源于真核生物早期的祖先。在分析Zip11在小鼠不同組織中的表達規(guī)律,發(fā)現(xiàn)mZip11在消化系統(tǒng)中高表達(胃、回腸與盲腸)。而在HEK293T細胞上轉染mZIP11質(zhì)粒與在RAW26.7細胞上沉默Zip11后,測定細胞內(nèi)鋅含量與MT的基因表達,證實ZIP11是一個鋅的轉入蛋白。給野生型小鼠補鋅后,發(fā)現(xiàn)Zipll無論是mRNA還是蛋白水平均顯著升高。隨后的熒光素酶報告基因分析發(fā)現(xiàn)Zip11第一個外顯子上游區(qū)域存在多個MRE序列,可響應細胞內(nèi)鋅的變化。突變分析的結果發(fā)現(xiàn)很多MRE可調(diào)控Zip11啟動子的活性,MTF-1參與到Zip11表達調(diào)控的過程中。總之,本實驗結果表明ZIP11具有特殊的序列與結構特征,負責細胞內(nèi)鋅的轉運,鋅通過MTF-1綁定到Zip11啟動子區(qū)域的MRE序列上調(diào)控Zipll的基因表達。實驗二：沙門氏菌感染對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機理研究實驗選用48只1dAA肉公雞,飼養(yǎng)7d后按體重無差異原則隨機分為兩組：組為對照組,另外一組為沙門氏菌攻毒組。分別在攻毒后第1、3與7d收集血清、肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊、十二指腸、空腸、回腸與盲腸等組織,用于鋅含量與鋅代謝相關基因的分析。同時,分離正常與被感染雞只的血液中性粒細胞,檢測鈣衛(wèi)蛋白與鋅代謝相關基因的表達。研究表明,7 d肉雞沙門氏菌感染后血清鋅顯著降低(P0.05),肝臟鋅明顯升高(P0.05),機體出現(xiàn)了典型的“低鋅血癥”。與對照組相比感染組十二指腸中鋅含量極顯著降低(P0.01),但法氏囊與盲腸中的鋅含量顯著升高(P0.05)。機體通過限制十二指腸對鋅的吸收,同時將鋅重分布到肝臟、法氏囊與盲腸等組織,從整體上調(diào)控鋅的穩(wěn)態(tài)平衡,來限制沙門氏菌對鋅的吸收與利用。除此之外,沙門氏菌感染后極顯著地增加中性粒細胞MT與S100A9的表達(P0.01)。機體通過改變中性粒細胞的鋅穩(wěn)態(tài),從而介導鈣衛(wèi)蛋白的表達與分泌,分泌到腸腔中的鈣衛(wèi)蛋白會螯合掉食糜中的鋅,進一步限制沙門氏菌對鋅的吸收與利用。沙門氏菌感染對肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)的影響主要是通過顯著改變宿主鋅轉運蛋白的表達來實現(xiàn)的(P0.05)。宿主通過上調(diào)鋅的轉入蛋白ZIP14,下調(diào)鋅的轉出蛋白ZNT1、ZNT、ZNT5、ZNT6、 ZNT8與ZNT9的表達將鋅重分布到肝臟；此外下調(diào)ZIP5、ZIP10、ZIP11、ZIP12、 ZIP13與ZIP14在十二指腸中的表達,限制鋅的吸收。進一步研究發(fā)現(xiàn),機體會上調(diào)中性粒細胞中的鋅轉運蛋白ZIP3、ZIP8、ZIP10與ZIP14的表達,增加中性粒細胞中的鋅含量,從而極顯著增加鈣衛(wèi)蛋白的表達(P0.01)�？傊�,沙門氏菌感染顯著影響肉雞的鋅穩(wěn)態(tài)。機體通過調(diào)控鋅轉運蛋白的表達在整體水平與細胞水平上分別介導鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控,來共同抵抗沙門氏菌的感染。多個鋅轉運蛋白在這個過程中發(fā)揮重要的作用,ZIP11也參與到其中。實驗三：巨噬細胞游離鋅調(diào)控在抗沙門氏菌感染中的作用與機理研究本研究以RAW264.7巨噬細胞為模型,在沙門氏菌感染的同時,通過添加鋅或鋅螯合劑改變巨噬細胞內(nèi)游離鋅的水平,利用熒光顯微、流式細胞儀、RT-PCR與免疫印跡等技術檢考察游離鋅改變對沙門氏菌感染與增殖的影響；同時考察游離鋅改變對宿主NF-κB信號通路以及ROS與RNS產(chǎn)生的影響。除此之外,還在MT1敲除的RAW264.7巨噬細胞上驗證之前的結果。研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞感染沙門氏菌后游離鋅會聚集在巨噬細胞內(nèi),并影響沙門氏菌的感染。螯合巨噬細胞內(nèi)的游離鋅通過增加巨噬細胞ROS與RNS的產(chǎn)生,增加巨噬細胞對沙門氏菌的殺傷,從而減少沙門氏菌的感染。相反,額外增加巨噬細胞的水平通過影響NF-κB p65的激活,減少ROS與RNS的產(chǎn)生,結果沙門氏菌在巨噬細胞內(nèi)生長得更好。在敲掉細胞內(nèi)重要的游離鋅綁定蛋白MT1后,沙門氏菌在MT1敲除的巨噬細胞內(nèi)生長的更好。這是由于伴隨巨噬細胞內(nèi)游離鋅含量升高的同時,細胞內(nèi)ROS與RNS的產(chǎn)生也減少。深入研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌陽性的細胞相比沙門氏菌陰性的細胞含有更多的自由鋅,而ROS與RNS的產(chǎn)生被抑制。這暗示感染后巨噬細胞游離鋅的聚集可能是沙門氏菌逃避NF-κB介導的巨噬細胞殺傷,長久地在巨噬細胞內(nèi)生存的新策略。綜上所述,ZIP11是一個鋅轉運蛋白,在機體鋅代謝過程中發(fā)揮重要作用。此外,ZIP11的mRNA與蛋白水平均受鋅調(diào)控,鋅調(diào)控ZIP11的表達主要通過MTF-1綁定到ZIP11扁動子區(qū)域的MRE序列上來實現(xiàn)。肉雞沙門氏菌感染后,機體通過調(diào)控十二指腸鋅的吸收,同時將鋅重分布到肝臟、法氏囊與粒細胞等組織或細胞,從整體與細胞水平上調(diào)控機體的鋅穩(wěn)態(tài),共同抵抗沙門氏菌的感染,ZIP11也參與到其中。在肉雞體內(nèi)沙門氏菌感染后,機體出現(xiàn)血清鋅降低,可能會減少體內(nèi)巨噬細胞內(nèi)游離鋅的含量,有利于宿主對沙門氏菌的清除。但值得注意的是,體外巨噬細胞沙門氏菌感染模型中的結果提示,沙門氏菌可通過改變巨噬細胞的鋅穩(wěn)態(tài),抑制巨噬細胞對其殺傷,長期在巨噬細胞內(nèi)存活。
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【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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相關博士學位論文 前1條

1 伍愛民;鋅轉運蛋白Zip11的功能及沙門氏菌攻擊對肉雞鋅穩(wěn)態(tài)的影響及調(diào)控機理研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2016年

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本文編號：1732295