發(fā)布時(shí)間：2018-04-13 09:40

  本文選題：鞘蕊蘇 + 茅蒼術(shù)��； 參考：《湖北中醫(yī)藥大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：本論文由兩部分組成,第一部分是鞘蕊蘇二萜類生物合成機(jī)制,第二部分是蒼術(shù)根莖、葉基因表達(dá)差異研究。第一部分:鞘蕊蘇藥材藥用植物名為毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Wild)Briq),系唇形科(Labiatae)鞘蕊花屬植物。野生毛喉鞘蕊花的發(fā)源地為印度次大陸,主要分布在印度、尼泊爾、緬甸、斯里蘭卡、泰國(guó)等亞熱帶國(guó)家,我國(guó)云南會(huì)澤、東川等地有少量發(fā)現(xiàn)植物學(xué)家界定為稀有物種。民間將該中草藥用于治療哮喘、咳嗽、腫瘤等疾患,療效顯著。鑒于鞘蕊蘇的獨(dú)特療效。湖北福人藥業(yè)公司將其開發(fā)為“鞘蕊蘇膠囊”中藥新藥,獲得生產(chǎn)批件【批件號(hào):2011S00365】。為了解決鞘蕊蘇膠囊產(chǎn)業(yè)化所需原料藥材的供求問(wèn)題,湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉焱文教授科研團(tuán)隊(duì)與湖北福人藥業(yè)公司產(chǎn)學(xué)研結(jié)合,從云南會(huì)澤縣移植鞘蕊蘇至湖北通城規(guī)范化種植。本論文對(duì)鞘蕊蘇5個(gè)二萜合成酶基因,即TPS1、TPS3、TPS4、TPS14和TPS15進(jìn)行克隆,并且研究其其特異性表達(dá),以期提鞘蕊蘇藥材二萜有效成分的含量,從而為通城種植鞘蕊蘇藥材培育優(yōu)良種質(zhì)提供了科學(xué)實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。1以鞘蕊蘇種子萌發(fā)2周左右的幼苗為試材,提取RNA并去除g DNA后反轉(zhuǎn)錄成c DNA,行成克隆模板。以二萜相關(guān)基因不同合成途徑CPS和KS的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,通過(guò)引物特異性PCR克隆出保守區(qū)域堿基片段,再通過(guò)3’RACE和5’RACE分別進(jìn)行3’和5’端編碼區(qū)全長(zhǎng)的擴(kuò)增,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接,利用拼接的引物設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增的引物,再次引物特異性PCR,最終得到基因的全長(zhǎng)序列?2對(duì)Cf TPS14、Cf TPS15的CDS序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)NCBI進(jìn)行Blast X比對(duì)分析,Cf TPS14為映式貝殼杉烯合成酶,Cf TPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。Cf TPS14等電點(diǎn)為5.38,分子式為C3987H6231N1073O1194S42,脂肪系數(shù)為91.35,主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.189,表現(xiàn)為親水性,細(xì)胞定位其分布在細(xì)胞膜外?Cf TPS15等電點(diǎn)為6.86,分子式為C3633H5629N993O1046S27,脂肪系數(shù)為87.65,主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.371,表現(xiàn)為親水性,細(xì)胞定位在細(xì)胞膜外?3針對(duì)測(cè)序得到的二萜相關(guān)基因保守區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)q PCR引物,設(shè)計(jì)原則為擴(kuò)增長(zhǎng)度:100-300 bp;引物長(zhǎng)度:18±2;Tm值:54±1℃;引物自身沒(méi)有發(fā)卡結(jié)構(gòu),引物之間不易形成二聚體結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果表明,Cf TPS1為柯巴基焦磷酸異構(gòu)體合成酶,Cf TPS3、Cf TPS4為丹參酮二烯和13R淚柏醚合成酶,Cf TPS14為映式貝殼杉烯合成酶,Cf TPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。Cf TPS1和Cf TPS3參與鐵銹醇前體丹參酮的合成,故Cf TPS1和Cf TPS3主要在根和根莖中表達(dá),莖中含量較少;Cf TPS3和Cf TPS4參與佛斯柯林前體13R淚柏醚的合成,因此Cf TPS3主要在根和根莖中表達(dá),Cf TPS4可能參與其他催化過(guò)程,因此在花和葉中含量較高;Cf TPS14和Cf TPS15參與次霉素前體映式貝殼杉烯的合成,因此在花和葉中含量較高,在根中含量較低。上述研究表明,q PCR分析結(jié)果與基因特異性表達(dá)趨勢(shì)基本一致。4以CfTPS15基因的CDS設(shè)計(jì)引物,并加入SalⅠ和NotI酶切位點(diǎn),采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到帶有酶切位點(diǎn)的基因CDS序列,通過(guò)酶切位點(diǎn)將Cf TPS15與表載體Pet28a連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞BL21,再通過(guò)加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)Cf TPS15基因的蛋白表達(dá)?第二部分:茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.)DC.(Compositae菊科),是我國(guó)傳統(tǒng)常用藥材。茅蒼術(shù)的根莖具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目等功效。主要有效成分為蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)醇和蒼術(shù)酮等萜類化合物。由于市場(chǎng)對(duì)茅蒼術(shù)的需求與日俱增,茅蒼術(shù)野生資源受到掠奪性采挖,導(dǎo)致數(shù)量銳減。因此,人工種植已成為必由之路。而如何提高茅蒼術(shù)根莖產(chǎn)量、保證藥材質(zhì)量是人工種植要解決的首要問(wèn)題。盡管茅蒼術(shù)的化學(xué)成分、藥理學(xué)、生理生化、栽培技術(shù)等研究較多,根莖形成和生長(zhǎng)的分子機(jī)制仍不清楚,很大一部分原因是缺乏茅蒼術(shù)基因組信息。近年來(lái)發(fā)展的高通量轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為茅蒼術(shù)功能基因組研究提供了有效手段。1以江蘇茅山的茅蒼術(shù)為研究對(duì)象,對(duì)其根莖和葉的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建了茅蒼術(shù)總RNA的c DN文庫(kù),采用Illumina Hi Seq2000平臺(tái)對(duì)茅蒼術(shù)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序和從頭組裝。通過(guò)移除adaptor序列和低質(zhì)量的讀序后,分別從葉和根莖轉(zhuǎn)錄組得到118,397,448和152,688,850clean reads;總核苷酸數(shù)達(dá)33,885,787,250 bp(20 G),平均讀序長(zhǎng)度均為125 bp;在所有的茅蒼術(shù)樣品中共計(jì)有22,891條unigene表達(dá),其中5,693條、4,502條、6,430條、3,504條和9,296條unigene分別在2份葉樣品和3份根莖樣品中表達(dá)�？偣灿�39,664條序列(占所有unigene總數(shù)的42.90%)與nr數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的基因相匹配,這些數(shù)列中的26,159(28.32%)條unigene被歸類到一個(gè)或多個(gè)GO項(xiàng)下。將unigene映射到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的參考代謝通路,總計(jì)10,504條unigene被注釋,可歸入289條KEGG代謝途徑;161個(gè)Unigenes功能被注解為CYP450s,屬于71 CYP家族類;92366個(gè)Unigenes中確定了10103個(gè)SSR,其中1074個(gè)Unigenes包含兩個(gè)以上的微衛(wèi)星D NA,而且406個(gè)SSR存在于復(fù)合形式。2茅蒼術(shù)葉和根莖轉(zhuǎn)錄組的特異性表達(dá)分析。在葉和根莖中轉(zhuǎn)錄豐度高的(FPKM1000)的基因分別有227條和105條,其中有47條在兩種組織中共存。GO富集分析中,4,982DEGs映射到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中,共有262個(gè)GO項(xiàng)目明顯富集。KEGG富集分析表明,1,158條上調(diào)的unigene與159條KEGG途徑相關(guān)聯(lián),其中29條unigene歸于植物激素信號(hào)傳導(dǎo)(ko04075),而多數(shù)unigene與淀粉和糖代謝(ko00500)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(ko04141)和氨基酸的生物合成(ko01230)相關(guān)。將茅蒼術(shù)的測(cè)序結(jié)果與AGRIS數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì),鑒別出42個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族;葉中共有60個(gè)轉(zhuǎn)錄子上調(diào),根莖中共有67個(gè)轉(zhuǎn)錄子上調(diào)。3選擇20個(gè)差異性表達(dá)基因(DEGs)的q PCR驗(yàn)證RNA測(cè)序和計(jì)算結(jié)果表明,所有選擇的基因q PCR相對(duì)表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄組分析具有相同的趨勢(shì)。測(cè)試了這些基因的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.81。4通過(guò)DEGs進(jìn)一步分析參與根莖起始和發(fā)育的候選基因,鑒定了104個(gè)基因共同參與器官發(fā)育、激素生物合成和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),其中包括一些轉(zhuǎn)錄因子(2個(gè)MADS盒蛋白,12個(gè)類AP2轉(zhuǎn)錄因子)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.239

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