發(fā)布時間：2018-05-11 18:15

  本文選題：甘藍型油菜 + 抗菌核病��； 參考：《西南大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：甘藍型油菜(Brassica napus L,2n=4x=38,AACC)是由白菜型油菜(B.rapa,2n=2x=20,AA)與甘藍(B.oleracea,2n=2x=18,CC)自然雜交后雙倍化得到的異源四倍體物種。它富含油脂和蛋白質(zhì),是全世界范圍內(nèi)廣泛種植的重要油料作物之一。甘藍型油菜不僅是重要的食用油,調(diào)味品和蛋白質(zhì)飼料來源,也是加工工業(yè)及生物能源的重要原料,而且可以為人類提供必要的維生素C和可溶性纖維。核盤菌引起的油菜莖稈腐爛是油菜生產(chǎn)中的首要病害,可以造成油菜產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降;另外,油菜的倒伏問題已成為制約油菜機械化收獲、影響產(chǎn)量和品質(zhì)、增加菌核病危害的重要因素之一。木質(zhì)素不僅可以增強植物體的機械強度,同時由于其疏水的化學(xué)特性,使植物免受病原菌的侵害和擴展,與植物抗病、抗倒伏有重要的關(guān)系。因此,研究甘藍型油菜莖稈木質(zhì)素在抗病和抗倒伏過程中的作用,鑒定抗性候選基因,可為油菜抗性育種提供理論基礎(chǔ)。本研究首先根據(jù)甘藍型油菜莖稈中的酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)和木質(zhì)素單體(G、S)含量值,建立近紅外模型,實現(xiàn)樣品中ADL和木質(zhì)素單體含量的快速測定;利用60K Brassica Illumina SNP芯片對莖稈菌核病抗性和抗倒伏性狀(莖稈直徑、折斷力和折斷強度)及木質(zhì)素和木質(zhì)素單體含量進行全基因組關(guān)聯(lián)分析,鑒定與抗性性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點及候選基因,并從轉(zhuǎn)錄組水平解析木質(zhì)素合成及甘藍型油菜抗病機理,具體研究結(jié)果如下:1.ADL和木質(zhì)素單體含量近紅外模型建立近紅外光譜是一種快速、無損準確的測定植物化學(xué)成分的新方法,本研究采用范式測定法測定了103份材料的莖稈ADL含量,采用GC-MS法測定了152份材料的木質(zhì)素單體含量,然后采集這些材料的近紅外數(shù)據(jù),根據(jù)馬氏距離選擇83份材料來建立ADL定標模型,選擇67份材料建立S型木質(zhì)素單體和G型木質(zhì)素單體模型,其余材料用于外部驗證。結(jié)果表明:(1)ADL最適模型為MPLS回歸分析,無散射和二階導(dǎo)數(shù)處理;S型和G型木質(zhì)素單體最適模型為PLS回歸分析,標準正�；�和散射處理(SNV+Detrend)及二階導(dǎo)數(shù)處理。(2)ADL模型決定系數(shù)(1-VR)約為0.90,外部驗證相關(guān)系數(shù)(RSQ)分別為0.87;G和S型木質(zhì)素單體交互驗證決定系數(shù)(1-VR)為0.97,外部驗證預(yù)測相關(guān)系數(shù)(RSQ)為0.86;表明本試驗中,ADL、S型和G型木質(zhì)素單體近紅外模型具有較好的預(yù)測效果,可以用于精確定量。2.抗性相關(guān)性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析為了從全基因組水平上解析甘藍型油菜抗病和抗倒伏機理,挖掘與抗性性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點,本研究以520份不同來源甘藍型油菜為材料,進行菌核病莖稈抗性鑒定,并測定莖稈中部直徑,折斷力,抗折強度(單位面積折斷力)及倒伏系數(shù);根據(jù)上述建立的ADL、S型和G型木質(zhì)素單體近紅外模型,測定各材料的ADL含量、S型和G型木質(zhì)素單體含量,由于H型木質(zhì)素單體含量很少,本研究后續(xù)分析從S型和G型木質(zhì)素單體比例(S/G)入手,探討木質(zhì)素單體比例與抗性的關(guān)系。這7個性狀都進行兩年兩次重復(fù)鑒定,同時利用60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型,進行甘藍型油菜抗性相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:(1)甘藍型油菜相對感病性與莖稈總木質(zhì)素含量無關(guān),但與木質(zhì)素單體比S/G達到顯著正相關(guān);莖稈直徑與折斷力達到顯著正相關(guān);莖稈折斷力和抗折強度與ADL木質(zhì)素總含量正相關(guān);莖稈ADL木質(zhì)素總量與木質(zhì)素單體比S/G達到極顯著正相關(guān),倒伏系數(shù)與抗折強度和木質(zhì)素單體比S/G達到顯著正相關(guān)。表明組成油菜莖稈木質(zhì)素時,S型木質(zhì)素單體含量較高,但G型木質(zhì)素單體在抗病和抗倒伏過程中起著重要作用,抗折強度可以作為評價倒伏的重要指標。(2)從60K SNP芯片中篩選出31468個有多態(tài)性和高質(zhì)量的SNP分析連鎖不平衡衰減距離。當LD的衰減閾值為0.1時,A基因組的衰退距離約為1 Mb,C基因組的衰退距離約為10 Mb,表明A基因組較C基因組衰減速度快,可能是中國半冬性甘藍型油菜在育種中A基因組發(fā)生較大重組,打破了連鎖不平衡。(3)根據(jù)SNP在染色體上位置,檢測各染色體單體型分布情況。A和C基因組平均單體型塊大小分別為133.3 kb和177.5 kb(F=8.5,P=0.019);A基因組每100 kb內(nèi)單體型塊數(shù)目平均為0.18,C基因組為0.04(F=102.5,P0.01)。A基因組單體型塊數(shù)目多,長度短,C基因組單體型塊數(shù)目少,長度長,表明A基因組較C基因組發(fā)生較大重組,打破之前的連鎖狀態(tài),被分割為多個長度小的單體型塊。(4)通過群體遺傳結(jié)構(gòu),Neighbor-join進化樹及主成分分析劃分自然群體類群。520份材料劃分為3個類群,亞群1(Group 1)包含53份材料,亞群2(Group2)包含348份材料,剩余的119份材料聚入混合亞群(Mixed),其分類與甘藍型油菜生態(tài)型一致。亞群1主要是由分布在中國甘肅和青海地區(qū)及歐洲的春油菜構(gòu)成,亞群2主要是由分布在長江流域地區(qū)的半冬性油菜構(gòu)成,包括重慶、四川、湖南、湖北及江蘇地區(qū)選育的品種。(5)對7個抗性相關(guān)性狀表型和60K Brassica Illumina SNP芯片分析的基因型進行全基因組關(guān)聯(lián)分析,共檢測到109個顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點。莖稈菌核病抗性利用K+P模型,鑒定出17個與抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點,分別位于A8染色體上的15.1 Mb和C6的31.3 Mb位置,A8上與菌核病抗性顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點位于長度為409 kb的單型體內(nèi),C6染色體上的SNP位點,與已經(jīng)報道的菌核病QTL位點有重疊;莖稈中部直徑利用K+Q模型,共檢測到3個SNP標記與直徑顯著關(guān)聯(lián),分別位于A2(6 Mb)和A7(18.5 Mb)染色體上;莖稈折斷力利用K+P和K+Q模型共檢測到關(guān)聯(lián)的11個SNP,位于A2染色體上約24.1 Mb,A7染色體上約20.9 Mb,A9染色體上約2.5 Mb和2.9 Mb,及C3染色體上約48.4 Mb;對抗折強度,檢測到7個與抗折強度相關(guān)聯(lián)的SNP位點位于A1染色體18 Mb,A5染色體20.3 Mb,A7染色體20.9 Mb;對倒伏系數(shù),檢測到5個與倒伏系數(shù)關(guān)聯(lián)SNP位點;對ADL,找到8個與木質(zhì)素含量關(guān)聯(lián)的SNP位點;對木質(zhì)素單體比S/G,幾乎在所有染色體都找到與其關(guān)聯(lián)的SNP位點,共找到58個顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(P1.37×10-5),當利用較為嚴格的閾值時(P1.58×10-6),共找到6個關(guān)聯(lián)SNP位點,位于A3染色體6.9 Mb和14.7-18.4 Mb,A6染色體17.9 Mb,A7染色體11.1 Mb。另外ADL木質(zhì)素與木質(zhì)素單體比S/G都在A1染色體約1.0Mb處找到顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點,并在附近找到與CAD5同源基因(Bna A01g02890D)。倒伏系數(shù)LC與木質(zhì)素單體比S/G,相對感病性與木質(zhì)素單體比S/G都找到共同的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點,表明木質(zhì)素單體在抗性過程中起著重要作用。(6)對7個抗性性狀進行全基因組選擇,7個性狀隨著參考材料數(shù)目的增加預(yù)測能力升高,但是標準差也隨著升高,結(jié)合預(yù)測能力和標準差,選用60%的參考材料時最為合適。利用所有標記進行全基因組選擇時,這些性狀的預(yù)測效率為0.23(直徑)-0.42(折斷力),預(yù)測效率很低;利用全基因組關(guān)聯(lián)分析顯著SNP位點(P0.05)進行全基因組預(yù)測時,相對感病性,預(yù)測能力為0.8,莖稈中部直徑、折斷力、抗折強度、ADL、木質(zhì)素單體比S/G預(yù)測能力都約為0.6-0.7,說明這些標記具有預(yù)測能力,全基因關(guān)聯(lián)分析檢測的顯著關(guān)聯(lián)位點可以提高性狀預(yù)測能力,促進全基因組選擇進程。3.甘藍型油菜木質(zhì)素合成基因表達差異分析為了了解甘藍型油菜莖稈木質(zhì)素合成過程中基因表達情況,本研究從520份材料中各選取5份高木質(zhì)素含量和低木質(zhì)素含量材料,在初花期取莖稈中部組織,利用高通量RNA-Seq測序技術(shù)構(gòu)建了油菜低木質(zhì)素(L1)和高木質(zhì)素(H2)轉(zhuǎn)錄組文庫,找到與木質(zhì)素合成相關(guān)的途徑及基因。主要研究結(jié)果如下:與低木質(zhì)素含量材料FPKM相比后,尋找表達值相差至少2倍的差異基因(|log2(H2/L1)|≥1,FDR0.01),與木質(zhì)素合成相關(guān)的差異表達基因共1013個,其中上調(diào)基因351個,下調(diào)基因662個。DGEs的GO富集分析進行統(tǒng)計檢驗,結(jié)果表明,與低木質(zhì)素材料中的基因相比,高木質(zhì)素材料上調(diào)基因位于細胞器,主要分子功能是轉(zhuǎn)運活性(transporter activity),主要參與在糖苷分解代謝過程(尤其是硫苷分解),葉片衰老和細胞壁生物合成過程中;下調(diào)基因主要參與次級代謝過程和硫苷生物合成過程中,表明硫苷代謝途徑與木質(zhì)素合成途徑相關(guān)。另外,對這些基因進行KEGG富集分析,上調(diào)表達基因中,沒有代謝途徑達到顯著富集水平;而下調(diào)表達基因有11個代謝途徑達到顯著富集水平。顯著富集的前5個代謝途徑為硫苷生物合成(ath00966)、氧帶羧酸代謝(ath01210)、硫代謝(ath00920)、硫胺素代謝(ath00730)和類黃酮代謝(ath00941),這個結(jié)果與GO富集分析結(jié)果一致。另外,我們還鑒定了一些在其他作物木質(zhì)素代謝途徑中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子基因(如MYB85和MYB103),也可以調(diào)控甘藍型油菜木質(zhì)素的生物合成。結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析,找到4CL5同源基因(Bna A03g36130D)。另外,我們還找到一個ERF轉(zhuǎn)錄因子基因SHINE(Bna A08g233880D),其可能參與木質(zhì)素生物合成。4.甘藍型油菜應(yīng)答核盤菌侵染的轉(zhuǎn)錄組分析為了從轉(zhuǎn)錄水平解析甘藍型油菜抗病機制,我們從520份材料中分別選擇5份極端抗病(R)和感病(S)甘藍型油菜,核盤菌脅迫接種莖稈48 h,分別取抗病材料和感病材料接種前后各10株混合樣提RNA,利用RNA-seq技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序,得到抗、感材料核盤菌脅迫處理后上調(diào)和下調(diào)的基因,結(jié)果如下:(1)根據(jù)|log2(FPKM48/FPKM0)|≥2,FDR0.01,R和S材料中接種前后共發(fā)現(xiàn)6821個差異基因,R中有5384個差異表達基因,包括2356個上調(diào)基因(43.8%)和3028個下調(diào)基因(56.2%);感病性材料(S)中共5386個,包括2229個上調(diào)基因(41.4%),3157個下調(diào)基因(58.6%)。其中共有的上調(diào)基因1784個,572個基因在R材料中特異上調(diào),445個基因在S材料中特異上調(diào);R和S材料共同下調(diào)的基因則有2166個,R材料特異下調(diào)基因862個,S材料特異下調(diào)基因991個。另外,對所有差異基因進行分層聚類發(fā)現(xiàn),R和S材料中差異基因表達模式一致,基因表達水平的差異主要表現(xiàn)為上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)的差異;(2)對共同表達差異基因進行了GO功能富集,從細胞組分,分子功能和參與的生物過程三個方面來分析。共同表達的上調(diào)基因主要在細胞部分(cell),其分子功能是催化和結(jié)合功能,編碼轉(zhuǎn)運蛋白,參與的生物過程為代謝過程,細胞過程,生物調(diào)節(jié)和對刺激的反應(yīng)。而下調(diào)的基因除了在細胞上,細胞器上的比例也很高,主要是與光合作用相關(guān)的葉綠體及類囊體;(3)對抗病和感病中共同表達的差異基因KEGG代謝途徑分析,結(jié)果表明,上調(diào)基因主要富集在谷胱甘肽代謝和次級代謝生物合成(硫代謝,硫苷生物合成和氧帶羧酸代謝中),下調(diào)基因主要富集在光合作用,乙醛酸和二羧酸代謝途徑,固碳作用,葉綠素代謝過程和碳代謝過程中;(4)對抗病和感病材料差異表達基因進行分析,找到一些特異的與抗性相關(guān)的途徑及基因,包括茉莉酸途徑,木質(zhì)素途徑,信號傳導(dǎo)途徑,防御反應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子基因。木質(zhì)素途徑中,R材料CCo AOMT基因全部上調(diào),上調(diào)的倍數(shù)大于感病材料;F5H基因在R和S材料中都表現(xiàn)為下調(diào)。CCo AOMT主要參與G型木質(zhì)素單體的合成,而F5H參與S型木質(zhì)素單體合成,表明G型木質(zhì)素單體在抗病過程中起著重要作用。(5)結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析,我們還找到21個基因在R或S材料中差異表達,包括4個功能未知基因,A8染色體上有8個,C6染色體上有13個;另外,在C6區(qū)間約330 kb處找到一個谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶基因簇上調(diào)約64倍。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S565.4
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本文編號：1875036