發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 18:30

　　 植物病毒是一類極為重要的病原物,對生產(chǎn)實(shí)踐造成了很大的危害。林木在社會(huì)經(jīng)濟(jì)及生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,林木病毒有廣泛的地理分布和寄主范圍,對森林健康、生態(tài)環(huán)境有很大的潛在威脅。蘊(yùn)藏在自然界木本植物中的病毒是個(gè)極大的未知數(shù)；同時(shí),木本植物上的病毒往往很難通過摩擦接種的方式進(jìn)行人工接種,利用傳統(tǒng)方法檢測木本植物病毒非常困難。小RNA深度測序技術(shù)突破了傳統(tǒng)病毒檢測方法的局限性,開辟了大規(guī)模、快速診斷植物病毒的領(lǐng)域。利用這種技術(shù)能同時(shí)檢測植物樣品中已知的和未知的、含量高的及含量低的所有的RNA病毒、DNA病毒以及類病毒。本文探討了小RNA深度測序及其組裝技術(shù)在檢測木本植物病毒中的應(yīng)用,以期全面地了解木本植物病毒的種類多樣性。我們的研究為發(fā)掘新的植物病毒資源以及預(yù)防林業(yè)生產(chǎn)上的病毒病害提供了指導(dǎo)。利用高通量測序技術(shù)對采自浙江杭州表現(xiàn)花葉癥狀的紫藤(W7isteria sinensis)采自浙江臨安表現(xiàn)花葉癥狀的南天竹(Nandina domestica)和浙江桐鄉(xiāng)表現(xiàn)花葉卷葉癥狀的桑樹(Morus alba L.)的病原進(jìn)行了分子鑒定。利用小RNA深度測序技術(shù),通過contigs拼接和比對,3種植物上的病毒分別為紫藤花葉病毒(Wisteria vein mosaic virus, WVMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CM IV)和桑花葉卷葉病相關(guān)病毒(Mulberry mosaic leaf roll-associated virus, MMLRaV),其中CMV侵染我國南天竹為國內(nèi)的首次報(bào)道。對采自浙江臨安表現(xiàn)花葉癥狀的美國山核桃(Carya illinoinensis (Wangenh.) K. Koch)樣品進(jìn)行了基于小RNA深度測序技術(shù)的高通量鑒定,該病毒為1種新的RNA病毒,暫命名為美國山核桃花葉相關(guān)病毒(Pecan mosaic-associated virus, PMaV)。PMaV基因組全長9310 nt,序列中A、T、C、G 4種堿基的含量分別為35.35%、25.49%、18.49%和20.66%,5’非編碼區(qū)(5’UTR)包含57個(gè)核苷酸,3’非編碼區(qū)(3’UTR)包含175個(gè)核苷酸。PMaV的基因組結(jié)構(gòu)具有典型的馬鈴薯Y病毒屬成員的基因組結(jié)構(gòu)特征,包含一個(gè)9078 nt的開放閱讀框(Open ReadingFrame,ORF),經(jīng)推導(dǎo)其編碼一個(gè)由3026個(gè)氨基酸(amino acid, aa)聚合而成的多聚蛋白,推測PMaV編碼的多聚蛋白翻譯后會(huì)被切割成11個(gè)成熟的蛋白質(zhì)：P1、HC-Pro、P3、6K1、C1、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP、PIPO。它的多聚蛋白切割位點(diǎn)分別是LYWRGF/S (P1/HC-Pro)、KLYKVG/G (HC-Pro/P3). DVITLQ/S (P3/6K1)、CMTFQ/S (6KI/C1)、DAIRFQ/S (C1/6K2)、DTITLQ/G (6K2/NIa-VPg)、DEIQFE/A (NIa-Vpg/NIa-Pro)、DSMKFQ/G (NIa-Pro/NIb)、 AGASAQ/S (NIb/CP).用PMaV基因組全序列與36種其他馬鈴薯Y病毒科成員的全序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。PMaV全序列與萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus, LMV)的相似度最高,為58.9%,并與LMV的進(jìn)化關(guān)系最為緊密,形成一個(gè)小進(jìn)化簇。PMaV多聚蛋白氨基酸全長序列與PVY屬其它病毒的同源性在52%-53%之間。PMaV的CP蛋白序列在核苷酸水平上與LMV的同源性最高,為73%；在CP氨基酸水平上的同源性與蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)最高,為68%。多聚蛋白氨基酸全長序列以及系統(tǒng)進(jìn)化樹均顯示PMaV與LMV的進(jìn)化關(guān)系最為緊密。由此可見,無論是按照Adams等人的標(biāo)準(zhǔn)：核苷酸一致性小于76%,且氨基酸一致性小于82%；還是按照ICTV第八次報(bào)告中確定的標(biāo)準(zhǔn)：核苷酸一致性小于85%,或CP氨基酸序列一致性小于80%,PMaV顯然符合Potyvirus屬不同種的定種標(biāo)準(zhǔn)。通過病毒汁液摩擦接種的方法,PMaV無法侵染本氏煙(Nicotiana benthamiana)和普通煙(N. tabacum)兩種供試植物。感病美國山核桃的葉片經(jīng)負(fù)染后,在透射電鏡下看到許多線狀的病毒粒子,呈柔軟彎曲或較直的線狀,長約750 nm,符合PVY屬病毒粒子的特征。對采自云南德宏州的檸檬(Citrus limon)病葉樣品進(jìn)行了基于深度測序技術(shù)的分子鑒定。結(jié)果表明,該檸檬受到了啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid, HSVd)的侵染。HSVd全長序列與HSVd CC-D isolate 1(( GenBank登錄號(hào)：FJ716188.1)的同源性為100%。在C. limon中,HSVd來源的小RNA(siRNAs)長度以21 nt為主,來源于HSVd正義鏈和負(fù)義鏈的siRNAs數(shù)量幾乎相等。HSVd-siRNAs序列的5’起始核苷酸堿基偏好于鳥嘌呤((Guanine, G).此外,熱點(diǎn)區(qū)分析顯示,大量的HSVd-siRNAs來源于HSVd基因組的C區(qū)和V區(qū)。植物類病毒的侵染和產(chǎn)生癥狀與類病毒來源的小RNA有關(guān),位于HSVd多變區(qū)(V區(qū))的5-6個(gè)核苷酸堿基構(gòu)成的木質(zhì)陷孔病表達(dá)序列“cachexia expression motif"決定了寄主癥狀的發(fā)生。利用生物信息學(xué)手段,我們從HSVd來源的小RNA中,提取到了67條5’端前10個(gè)堿基包含“cachexia expression motif"序列的HSVd-siRNA,然后通過預(yù)測軟件psRNA Target對 HSVd-siRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測,對其中五個(gè)數(shù)值最高的靶基因與癥狀發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了分析。同時(shí),用miRNA靶基因預(yù)測軟件RNA22驗(yàn)證了這五個(gè)靶基因是由HSVd-siRNAs所調(diào)控的。我們的研究結(jié)果表明,HSVd-siRNAs可能參與了寄主的基因表達(dá),并影響寄主病害癥狀的產(chǎn)生。通過高通量小RNA測序?qū)Σ勺哉憬�臨安的表現(xiàn)花葉癥狀的大青樣品進(jìn)行了病毒鑒定,該病毒為中國大青金色花葉病毒(Clerodendrum golden mosaic china virus, C1GMCNV). C1GMCNV的DNA-A組份全序列長2776 bp,與Clerodendrum golden mosaic China virus complete DNA-A genome, isolate YX1 (GenBank登錄號(hào)：FN396962.1)相似性為99%；DNA-B組份全序列長2729 bp,與Clerodendrum golden mosaic China virus complete DNA-B genome, isolate YX1 (GenBank登錄號(hào)：FN396963.1)同源性98%。采用了Velvet和Velvet-Oases兩種方法,并設(shè)定了不同的參數(shù)(k-mer分別為15、17、19、21),對大青樣品的深度測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn),在對序列進(jìn)行拼接比對時(shí),不同的拼接軟件和不同的參數(shù)設(shè)置對實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有很大的影響。利用Velvet軟件,K-mer為15時(shí),拼接得到的contigs數(shù)量及長度最大,可以覆蓋C1GMCNV基因組全長70%以上,而K-mer為21時(shí),拼接得到的contigs僅僅能覆蓋C1GMCNV基因組全長30%左右。利用Velvet-Oases分析方法,我們將不同K-mer值組裝的contigs又進(jìn)行了拼接組裝,發(fā)現(xiàn)最終得到的contigs覆蓋到基因組的比例顯著提高,最高達(dá)到88.25%。我們的研究提供了一套利用small RNA深度測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定病毒以及組裝得到病毒基因組的流程。為了更加清楚地看到深度測序所得到的病毒來源小RNA在病毒基因組上的分布情況,我們用可視化工具SeqMonk對測序得到的小RNA序列進(jìn)行了全基因組瀏覽,結(jié)果顯示C1GMCNV不同組分的基因組全長上,明顯存在沒有病毒源小RNA覆蓋的區(qū)域。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

物（Ｂａｃｋｗａｒｄ?Ｉｎｎｅｒ?Ｐｒｉｍｅｒ，ＢＩＰ）由Ｂｌｃ和Ｂ２組成，Ｂ２與目的基因３’端的Ｂ２ｃ堿??基互補(bǔ)，Ｂｌｃ即目的基因５’端的Ｂｌｃ序列；下游外部引物（Ｂａｃｋｗａｒｄ?Ｏｕｔｅｒ?Ｐｒｉｍｅｒ）??巧Ｂ３，與目的基因的Ｂ３ｃ堿基互補(bǔ)候?yàn)槠�，２０１２；圖１．１）。??Ｐｉｉｍｅｉ?ｆｏｒ?ＬＡＭＰ?ｉｉｉｅｔｌｉｏｄ??ｏｕｔｅｒ?ｐｎａｉｅｉ＇ｓ??＼??？‘?１＆控?＆?陛醫(yī)??戸ｔｉ＂ｎ＇Ｌ＂?＇?Ｊ．，＇，???．．．．腳ａｌ＇＇＇＇＇＇＇．＇＇＇＇＇＇＇＇＇＇隹＇。＇偏＂。一屯…＂ＩＩＩＩＩＩ才???又??ｙ?ｃｉｒＤ－ｃ＝－？＊？ｃｚｚｉ???Ｆ３Ｃ?巧Ｃ?ＬＦ?ＦｌＣ?Ｂ１?Ｂ２?Ｂ３??ｏＭｆ?符’?ｐｒｉｍ?樹＇ｓ??ｆｔｒｉｆ！粉》５＊—ＥＺＺＩ￣Ｉ?！—３＊?ＦＪ?３＊??ＦｌＣ?Ｆ２?－??院Ｔ?庫化ｉ？？ｒ）?Ｋｉ－－－—＊?技?Ｊ??３＊??ＢｌＣ?Ｂ２?＊??ＵＰ?５’?ｉｌｉｉｌ—３＊??ＬＢ?５＊?—ｒ￣￣ｉ—３＇??圖１．１?ＬＡＭＰ引物結(jié)構(gòu)圖。（吳為奇，２０１２）??巧ｇ．?１．１?Ｔｈｅ?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｐｒｉｍｅｒｓ．?（Ｗａ?２（ｈ?２）??８??

生物學(xué)研究的發(fā)展。ＤＮＡ測序技術(shù)經(jīng)歷了從Ｗ?Ｓａｎｇｅｒ法為代表的第一代測序技??術(shù)，到１＾（高通量測序技術(shù)（１１１６１１－也１〇１１３１１１）山ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，?１１１８）為代表的第二代測序??技術(shù)，再到１＾乂單分子測序技術(shù)或代表的第Ｓ代測序技術(shù)的漫長發(fā)展過程（圖１．２）。??１０??

圖２．１�。遥危辽疃葴y序流程圖。??Ｆｉｇ．?２．１?Ｓｅｑｕｅｎｃｉ打ｇ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ｏｆ?ｓｍａｌｌ?ＲＮＡ?ｄｅｅｐ?化ｑｕｅ打ｃｉｎｇ．??２．３．１樣品ＲＮＡ的準(zhǔn)備??

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