CsMYB60對(duì)原花青素生物合成及灰霉病相關(guān)基因CsWRKY10的調(diào)控作用
發(fā)布時(shí)間：2020-10-31 18:39
黃瓜(Cucumis sativus)是深受人們喜愛(ài)的一種世界性蔬菜,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)是目前世界上黃瓜種植規(guī)模和產(chǎn)量最大的國(guó)家。因此,改善黃瓜品質(zhì),提高其抗性,實(shí)現(xiàn)黃瓜的優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室前期以兩個(gè)黃瓜自交系RNS8(白刺品種)和RNS9(黑刺品種)為材料,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析,揭示了黃瓜黑刺中含有黃酮醇化合物,并將定位區(qū)間內(nèi)的一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMYB60定為B(Black spine)候選基因。然而黑刺分離所得的黃酮醇化合物的顏色并不是黑色的,說(shuō)明黑刺中除黃酮醇之外還含有其他代謝物。因此,黃瓜黑刺中代謝物的種類和其生物合成的調(diào)控機(jī)制,CsMYB60是否為B基因以及該基因的功能都需進(jìn)一步研究。本文通過(guò)相關(guān)生理生化試驗(yàn),鑒定出黃瓜黑刺中含有原花青素物質(zhì),并解析了CsMYB60基因調(diào)控黃瓜原花青素合成的分子機(jī)制以及該基因在抗病性方面的生物學(xué)功能。具體研究結(jié)果如下:1.通過(guò)DMACA化學(xué)組織染色法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定黃瓜黑刺中含有原花青素物質(zhì)。2.測(cè)序結(jié)果表明,22個(gè)不同黑白刺黃瓜自交系中CsMYB60基因序列存在多態(tài)性。與RNS9中CsMYB60基因的序列相比,其中5個(gè)白刺自交系的等位基因中均含有一個(gè)SNP,另外9個(gè)白刺自交系的等位基因中有一個(gè)大片段的插入。同時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明黃瓜黑刺自交系中CsMYB60基因的表達(dá)量均顯著高于白刺自交系。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,在黃瓜果刺的不同發(fā)育時(shí)期,RNS9中CsMYB60與原花青素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著高于RNS8。同時(shí),運(yùn)用基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和高效液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)證明了分別過(guò)表達(dá)CsMYB60和Cs4CL可以誘導(dǎo)白刺中積累原花青素。表明CsMYB60通過(guò)調(diào)控Cs4CL促進(jìn)黃瓜黑刺中原花青素的合成。4.測(cè)序結(jié)果分析表明,RNS8中CsMYB60基因的內(nèi)含子區(qū)域插入了一個(gè)轉(zhuǎn)座元件—CsMULE(Mutator-like element)。同時(shí),McrBC酶切法和重亞硫酸鹽測(cè)序法證明,RNS8中CsMYB60啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度高于RNS9。表明在RNS8中,CsMYB60內(nèi)含子區(qū)域轉(zhuǎn)座子的插入可能影響了其啟動(dòng)子的甲基化水平。5.與WT相比,CsMYB60過(guò)表達(dá)株系的葉片中總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量顯著降低,果實(shí)中VC和可溶性糖的含量顯著增加且多種揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量都顯著升高,其中最具黃瓜果實(shí)特征性風(fēng)味的反,順-2,6-壬二烯醛的含量變化最為顯著。表明,過(guò)表達(dá)CsMYB60提高了黃瓜的果實(shí)品質(zhì)。6.接種灰霉病菌后,CsMYB60過(guò)表達(dá)株系的病斑面積約為WT的兩倍,且茉莉酸和H_2O_2的含量顯著低于WT。表明過(guò)表達(dá)CsMYB60通過(guò)減少茉莉酸和H_2O_2的含量降低了黃瓜對(duì)灰霉病的抗性。7.通過(guò)黃瓜子葉瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),篩選出CsWRKY50、CsWRKY10、CsWRKY47三個(gè)可能參與到CsMYB60調(diào)控黃瓜響應(yīng)灰霉病菌過(guò)程的基因。進(jìn)一步通過(guò)人工接種病原菌發(fā)現(xiàn),CsWRKY10基因表達(dá)量受灰霉病菌誘導(dǎo)最為強(qiáng)烈,且在CsWRKY10啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)MYB蛋白結(jié)合的順式作用元件。同時(shí),酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證明,CsMYB60可以直接結(jié)合CsWRKY10的啟動(dòng)子。表明CsWRKY10很可能作為CsMYB60的下游基因調(diào)控黃瓜對(duì)灰霉病的抗性。8.通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系得到CsWRKY10過(guò)表達(dá)植株,人工接種灰霉病菌后發(fā)現(xiàn),與WT相比,轉(zhuǎn)基因株系的病斑面積顯著增加,H_2O_2和O_2~-的含量顯著降低。利用光學(xué)顯微鏡對(duì)灰霉病菌侵染W(wǎng)T和轉(zhuǎn)基因植株的過(guò)程進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)接種8 h后,轉(zhuǎn)基因株系上有個(gè)別孢子開(kāi)始萌發(fā),而WT上的孢子均沒(méi)有萌發(fā);接種10 h后,WT的孢子部分萌發(fā),而轉(zhuǎn)基因植株上的孢子幾乎全部萌發(fā)且芽管顯著伸長(zhǎng);隨著侵染時(shí)間的增加,相同時(shí)間下CsWRKY10過(guò)表達(dá)株系上菌絲的蔓延程度明顯高于WT。表明過(guò)表達(dá)CsWRKY10減少植株中ROS積累,促進(jìn)灰霉病菌孢子萌發(fā)及菌絲伸長(zhǎng),增加對(duì)灰霉病的敏感性。9.接種灰霉病菌后,與WT相比,CsWRKY10過(guò)表達(dá)株系中茉莉酸的含量顯著降低;茉莉酸介導(dǎo)的抗病途徑的關(guān)鍵基因CsMYC2表達(dá)量顯著上升,CsPDF1.2表達(dá)量顯著下降,而水楊酸信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因CsICS及CsPR1的表達(dá)量均顯著升高。表明在受到灰霉病菌侵染后,CsWRKY10參與激活了水楊酸信號(hào)通路,但是抑制了茉莉酸介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑。10.CsWRKY10可以被活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌—靶斑病菌所誘導(dǎo);并且接種病原菌后,CsWRKY10過(guò)表達(dá)株系的病斑面積顯著小于WT。表明過(guò)表達(dá)CsWRKY10提高了黃瓜對(duì)靶斑病的抗性。本研究揭示了CsMYB60基因的多重功能。過(guò)表達(dá)CsMYB60正調(diào)控黃瓜果刺中原花青素的合成,并通過(guò)增加果實(shí)中VC、可溶性糖和揮發(fā)性物質(zhì)的含量來(lái)提高黃瓜果實(shí)品質(zhì);并且CsMYB60直接調(diào)控CsWRKY10基因的表達(dá),減少ROS的含量,同時(shí)抑制茉莉酸的合成及其介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑,從而降低黃瓜對(duì)灰霉病的抗性。以上結(jié)果說(shuō)明了生物中基因的多效性,同時(shí)也為今后通過(guò)分子設(shè)計(jì)育種改良黃瓜的品質(zhì)和抗病性提供了一定的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S436.412.13
【部分圖文】：
原花青素特異途徑包括無(wú)色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)和花青素還原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)兩條途徑。無(wú)色花青素還原酶可以直接將無(wú)色花青素催化成2,3-反式黃烷-3-醇(2,3-trans-flavan-3-ol,catechin,兒茶素),主要包括兒茶素C和沒(méi)食子兒茶素GC(194)�；ㄇ嗨剡�原酶可以催化花青素生成2,3-順式黃烷-3-醇(2,3-cis-flavan-3-ol,epicatechm,表兒茶素),主要包括兒茶素EC和表沒(méi)食子兒茶素EGC(Yuan et al.,2012)。兒茶素和表兒茶素是原花青素的單體,最終聚合形成原花青素。1.2.1.2原花青素合成的分子調(diào)控機(jī)制
植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子在N端均含有一段約51~52個(gè)氨基組成的MYB結(jié)構(gòu)域。MYB結(jié)構(gòu)域折疊成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)的形式與DNA大溝結(jié)合(Riechmann et al.,2000;Lipsick,1996),而MYB蛋白中均含有1~3個(gè)串聯(lián)且不完全重復(fù)的MYB結(jié)構(gòu)域(R1、R2和R3)。根據(jù)MYB蛋白中該結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù),將其分為4類:單一的MYB結(jié)構(gòu)域(R1/R2)亞類;含有兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3MYB亞類;含有三個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R1R2R3MYB亞類;含有四個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的4RMYB亞類(劉守梅等,2012;Dubos et al.,2010;圖2)。其中,最小的亞家族是4R-MYB,成員均含有4個(gè)R1/R2重復(fù)序列(圖2),例如擬南芥的At3g18100基因。R2R3MYB亞類成員數(shù)目是最多的,參與到了控制細(xì)胞分化、次生代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)答激素刺激和抵御病原菌侵染等過(guò)程中(陳俊和王宗陽(yáng),2002)。1.2.2.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子功能研究進(jìn)展
茉莉酸不僅可以直接抑制病原菌的生長(zhǎng),在植物抵御灰霉病菌的過(guò)程中,茉莉酸更主要的是作為一種信號(hào)物質(zhì),激活抗病途徑,誘導(dǎo)產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白以及其他抗菌物質(zhì)。JA信號(hào)模塊主要由以下三部分組成:F-box蛋白、CORONATIN INSENSITIVE1(COI1)、Cullin1和Skp1-like1形成的具有功能性的Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合物(Du et al.,2017);轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ(jasmonate-ZIM domain)蛋白(Yan et al.,2007);JA通路的關(guān)鍵調(diào)控因子MYC2(Zhai et al.,2013)。正常情況下,JAZ蛋白與MYC2結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)植物受到病原體侵染時(shí),JA水平升高導(dǎo)致SCFCOI1復(fù)合物識(shí)別JAZ蛋白并使其泛素化,進(jìn)而被26S蛋白酶體選擇性降解,解除了JAZ蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2轉(zhuǎn)錄活性的抑制,從而激活JA應(yīng)答基因的表達(dá),增強(qiáng)抗病性。前人研究結(jié)果表明,番茄中茉莉酸不敏感突變體(jai1)的灰霉病斑大小是野生型的3倍。SlMYC2通過(guò)調(diào)控病原菌應(yīng)答基因正向調(diào)控植株對(duì)灰霉病的抗性,相反SlMYC2-RNAi植株對(duì)灰霉病的敏感性顯著高于WT(Du et al.,2017;圖3)。在擬南芥中,ANAC019和ANAC055通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控JA誘導(dǎo)的防御基因VSP1和LOX2的表達(dá)參與JA介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。anac019 anac055雙突變體中VSP1和LOX2的表達(dá)水平降低導(dǎo)致植株對(duì)B.cinerea的敏感性增強(qiáng)(Bu et al.,2005)。在抵抗病原菌方面,不同植物激素信號(hào)途徑之間往往存在著連接和交叉,相互協(xié)同或相互拮抗,形成精細(xì)而復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。茉莉酸調(diào)控寄主對(duì)灰霉病菌的抗性也不是一個(gè)簡(jiǎn)單的線性途徑,而是與其他信號(hào)途徑相互作用共同調(diào)節(jié)的結(jié)果(Devoto and Turner,2005)。在擬南芥中,ERF1基因?qū)颐共】剐缘恼{(diào)控依賴于茉莉酸和乙烯信號(hào)通路(Lorenzo et al.,2003)。ERF1過(guò)表達(dá)植株中防御響應(yīng)基因PDF1.2的表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)而提高對(duì)灰霉病的抗性(Berrocal-Lobo et al.,2002)。與ERF1一樣,ORA59在茉莉酸/乙烯介導(dǎo)的植物對(duì)B.cinerea的防御響應(yīng)中也起重要作用(Zarei et al.,2011),過(guò)表達(dá)ORA59可以激活PDF1.2的表達(dá),增強(qiáng)植物對(duì)B.cinerea的抗性(Pre et al.,2008)。以上結(jié)果表明,ERF1和ORA59是植物抵抗B.cinerea反應(yīng)中茉莉酸和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交叉點(diǎn),這也為茉莉酸和乙烯兩種激素相互作用提供了證據(jù)。同時(shí)水楊酸會(huì)通過(guò)其信號(hào)途徑的下游基因抑制ORA59蛋白的積累,說(shuō)明水楊酸與茉莉酸/乙烯存在拮抗作用(Van der Does et al.,2013)。WRKY33基因在植物對(duì)B.cinerea的防御反應(yīng)中起正調(diào)控的作用。wrky33突變體對(duì)B.cinerea感病性增強(qiáng),這與突變體中水楊酸響應(yīng)基因PR-1、PR-5和PAD4的強(qiáng)烈表達(dá)以及茉莉酸調(diào)控基因PDF1.2的表達(dá)降低相一致(Zheng et al.,2006),WRKY33可能作為水楊酸和茉莉酸相互拮抗的中間點(diǎn)發(fā)揮作用。此外,脫落酸對(duì)植物抗灰霉病的影響與B.cinerea侵染的階段及組織有關(guān),有脫落酸缺陷的sitinen番茄突變體和脫落酸響應(yīng)因子ABI5的突變體植株均對(duì)灰霉病有顯著抗性(Asselbergh et al.,2007)。同時(shí),脫落酸誘導(dǎo)番茄中轉(zhuǎn)錄因子AIM1正向調(diào)節(jié)早期對(duì)B.cinerea的防衛(wèi)反應(yīng)(Abuqamar et al.,2009)。
【相似文獻(xiàn)】
本文編號(hào)：2864345
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S436.412.13
【部分圖文】：
原花青素特異途徑包括無(wú)色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase,LAR)和花青素還原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)兩條途徑。無(wú)色花青素還原酶可以直接將無(wú)色花青素催化成2,3-反式黃烷-3-醇(2,3-trans-flavan-3-ol,catechin,兒茶素),主要包括兒茶素C和沒(méi)食子兒茶素GC(194)�；ㄇ嗨剡�原酶可以催化花青素生成2,3-順式黃烷-3-醇(2,3-cis-flavan-3-ol,epicatechm,表兒茶素),主要包括兒茶素EC和表沒(méi)食子兒茶素EGC(Yuan et al.,2012)。兒茶素和表兒茶素是原花青素的單體,最終聚合形成原花青素。1.2.1.2原花青素合成的分子調(diào)控機(jī)制
植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子在N端均含有一段約51~52個(gè)氨基組成的MYB結(jié)構(gòu)域。MYB結(jié)構(gòu)域折疊成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)的形式與DNA大溝結(jié)合(Riechmann et al.,2000;Lipsick,1996),而MYB蛋白中均含有1~3個(gè)串聯(lián)且不完全重復(fù)的MYB結(jié)構(gòu)域(R1、R2和R3)。根據(jù)MYB蛋白中該結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù),將其分為4類:單一的MYB結(jié)構(gòu)域(R1/R2)亞類;含有兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R2R3MYB亞類;含有三個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的R1R2R3MYB亞類;含有四個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的4RMYB亞類(劉守梅等,2012;Dubos et al.,2010;圖2)。其中,最小的亞家族是4R-MYB,成員均含有4個(gè)R1/R2重復(fù)序列(圖2),例如擬南芥的At3g18100基因。R2R3MYB亞類成員數(shù)目是最多的,參與到了控制細(xì)胞分化、次生代謝調(diào)節(jié)、應(yīng)答激素刺激和抵御病原菌侵染等過(guò)程中(陳俊和王宗陽(yáng),2002)。1.2.2.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子功能研究進(jìn)展
茉莉酸不僅可以直接抑制病原菌的生長(zhǎng),在植物抵御灰霉病菌的過(guò)程中,茉莉酸更主要的是作為一種信號(hào)物質(zhì),激活抗病途徑,誘導(dǎo)產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白以及其他抗菌物質(zhì)。JA信號(hào)模塊主要由以下三部分組成:F-box蛋白、CORONATIN INSENSITIVE1(COI1)、Cullin1和Skp1-like1形成的具有功能性的Skp-Cullin-F-box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合物(Du et al.,2017);轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ(jasmonate-ZIM domain)蛋白(Yan et al.,2007);JA通路的關(guān)鍵調(diào)控因子MYC2(Zhai et al.,2013)。正常情況下,JAZ蛋白與MYC2結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)植物受到病原體侵染時(shí),JA水平升高導(dǎo)致SCFCOI1復(fù)合物識(shí)別JAZ蛋白并使其泛素化,進(jìn)而被26S蛋白酶體選擇性降解,解除了JAZ蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2轉(zhuǎn)錄活性的抑制,從而激活JA應(yīng)答基因的表達(dá),增強(qiáng)抗病性。前人研究結(jié)果表明,番茄中茉莉酸不敏感突變體(jai1)的灰霉病斑大小是野生型的3倍。SlMYC2通過(guò)調(diào)控病原菌應(yīng)答基因正向調(diào)控植株對(duì)灰霉病的抗性,相反SlMYC2-RNAi植株對(duì)灰霉病的敏感性顯著高于WT(Du et al.,2017;圖3)。在擬南芥中,ANAC019和ANAC055通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控JA誘導(dǎo)的防御基因VSP1和LOX2的表達(dá)參與JA介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)。anac019 anac055雙突變體中VSP1和LOX2的表達(dá)水平降低導(dǎo)致植株對(duì)B.cinerea的敏感性增強(qiáng)(Bu et al.,2005)。在抵抗病原菌方面,不同植物激素信號(hào)途徑之間往往存在著連接和交叉,相互協(xié)同或相互拮抗,形成精細(xì)而復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。茉莉酸調(diào)控寄主對(duì)灰霉病菌的抗性也不是一個(gè)簡(jiǎn)單的線性途徑,而是與其他信號(hào)途徑相互作用共同調(diào)節(jié)的結(jié)果(Devoto and Turner,2005)。在擬南芥中,ERF1基因?qū)颐共】剐缘恼{(diào)控依賴于茉莉酸和乙烯信號(hào)通路(Lorenzo et al.,2003)。ERF1過(guò)表達(dá)植株中防御響應(yīng)基因PDF1.2的表達(dá)增強(qiáng),進(jìn)而提高對(duì)灰霉病的抗性(Berrocal-Lobo et al.,2002)。與ERF1一樣,ORA59在茉莉酸/乙烯介導(dǎo)的植物對(duì)B.cinerea的防御響應(yīng)中也起重要作用(Zarei et al.,2011),過(guò)表達(dá)ORA59可以激活PDF1.2的表達(dá),增強(qiáng)植物對(duì)B.cinerea的抗性(Pre et al.,2008)。以上結(jié)果表明,ERF1和ORA59是植物抵抗B.cinerea反應(yīng)中茉莉酸和乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑的交叉點(diǎn),這也為茉莉酸和乙烯兩種激素相互作用提供了證據(jù)。同時(shí)水楊酸會(huì)通過(guò)其信號(hào)途徑的下游基因抑制ORA59蛋白的積累,說(shuō)明水楊酸與茉莉酸/乙烯存在拮抗作用(Van der Does et al.,2013)。WRKY33基因在植物對(duì)B.cinerea的防御反應(yīng)中起正調(diào)控的作用。wrky33突變體對(duì)B.cinerea感病性增強(qiáng),這與突變體中水楊酸響應(yīng)基因PR-1、PR-5和PAD4的強(qiáng)烈表達(dá)以及茉莉酸調(diào)控基因PDF1.2的表達(dá)降低相一致(Zheng et al.,2006),WRKY33可能作為水楊酸和茉莉酸相互拮抗的中間點(diǎn)發(fā)揮作用。此外,脫落酸對(duì)植物抗灰霉病的影響與B.cinerea侵染的階段及組織有關(guān),有脫落酸缺陷的sitinen番茄突變體和脫落酸響應(yīng)因子ABI5的突變體植株均對(duì)灰霉病有顯著抗性(Asselbergh et al.,2007)。同時(shí),脫落酸誘導(dǎo)番茄中轉(zhuǎn)錄因子AIM1正向調(diào)節(jié)早期對(duì)B.cinerea的防衛(wèi)反應(yīng)(Abuqamar et al.,2009)。
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1 劉夢(mèng)雨;CsMYB60對(duì)原花青素生物合成及灰霉病相關(guān)基因CsWRKY10的調(diào)控作用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2020年
2 李佳林;CsMYB60調(diào)控黃瓜類黃酮生物合成的分子機(jī)制[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2020年
本文編號(hào)：2864345
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